健骨伸筋湯對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖與凋亡的影響

劉洪波，靖春穎通信作者：靖春穎，碩士，講師，電話－5008060706，謝毅強(qiáng)，韓 平（.海南醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院，?？?799；.海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，海口5700）

健骨伸筋湯對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖與凋亡的影響

劉洪波1，靖春穎1*通信作者：靖春穎，碩士，講師，電話－15008060706，謝毅強(qiáng)1，韓 平2
（1.海南醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院，海口571199；2.海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，?？?70102）

目的 探討健骨伸筋湯對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法 采用改良的Hulth法造模，造模2周后，開始對(duì)空白對(duì)照組、模型組生理鹽水灌胃；對(duì)照組壯骨關(guān)節(jié)丸灌胃；治療組分低、高濃度進(jìn)行中藥灌胃，第13周處死，通過(guò)免疫組化、TUNEL法檢測(cè)軟骨細(xì)胞的增殖與凋亡。說(shuō)明健骨伸筋湯可以通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖與凋亡防治骨關(guān)節(jié)炎。結(jié)果 健骨伸筋湯方含藥血清各濃度組的軟骨細(xì)胞增殖指數(shù)值明顯高于對(duì)照組及模型組（P＜0.05），軟骨細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組及模型組（P＜0.05）。結(jié)論 健骨伸筋湯可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，還可以抑制軟骨細(xì)胞異常凋亡，從而起到防治骨關(guān)節(jié)炎的作用。

健骨伸筋湯；大鼠；膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；增殖與凋亡

健骨伸筋湯是治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)長(zhǎng)期的臨床運(yùn)用及觀察發(fā)現(xiàn)，健骨伸筋湯可減緩骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)展［1］。骨關(guān)節(jié)炎是一種最常見的非化膿性、慢性骨關(guān)節(jié)病。臨床上主要分為原發(fā)性和繼發(fā)性［2］。主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、腫大、畸形及功能障礙，而且還常伴有繼發(fā)性滑膜炎等疾病。中醫(yī)中藥在改善臨床癥狀，提高患者生活質(zhì)量方面［3-4］能起到很好的效果。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只SPF級(jí)雌性健康4月齡SD大鼠，空腹體質(zhì)量120～150 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)：SCXK〔湘〕2009-0012）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 健骨伸筋湯：由海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院制備，按人與動(dòng)物體表面積折算等效計(jì)量比值折算成大鼠生藥量。濃縮含生藥2 g/mL，4℃保存。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、Ⅱ膠原酶（Sigma，美國(guó)），購(gòu)自海南綠葉生物制藥有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組 40只雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只：A組（空白對(duì)照組）、B組（造模組）、C組（壯骨關(guān)節(jié)丸組）、D組（健骨伸筋湯低劑量組）、E組（健骨伸筋湯高劑量組）。

2.2 造模方法 通過(guò)改良的Hulth法（取背側(cè)切口切除雙側(cè)卵巢，再按照Hulth［5］法）：將大鼠麻醉后，仰臥于手術(shù)臺(tái)上，無(wú)菌條件下取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口長(zhǎng)約2 cm，顯露膝關(guān)節(jié)，然后切斷前后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板，注意勿損傷關(guān)節(jié)軟骨面，制成腎虛型大鼠的膝骨性關(guān)節(jié)炎模型。術(shù)畢無(wú)菌敷料包扎，不固定傷肢。術(shù)后每天每只大鼠肌肉注射青霉素 20萬(wàn) U，共 1周。術(shù)后每天強(qiáng)迫大鼠活動(dòng)30 min。2周后隨機(jī)處死造模成功的1只大鼠，切取雙側(cè)股骨髁軟骨處理后，電鏡下觀察，證實(shí)造模成功后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)研究。

2.3 給藥方法 造模成功后，開始對(duì)空白對(duì)照組、模型組0.9％生理鹽水灌胃；治療組分低（含生藥濃度20％）、高（含生藥濃度80％）濃度進(jìn)行中藥灌胃（中藥方劑：骨碎補(bǔ)、鹿銜草、丹參、牛膝、薏苡仁、五加皮、穿山龍）。對(duì)照組：壯骨關(guān)節(jié)丸；大鼠劑量（mg/kg）＝系數(shù)（6.25）×人的劑量（mg/kg）［6］。

2.4 取材 全部動(dòng)物在13周末處死，立即解剖右側(cè)膝關(guān)節(jié)，銳刀片切取1 cm3大小股骨內(nèi)髁全層軟骨，置入無(wú)菌平皿，帶入超凈工作臺(tái)。尖刀片削下每個(gè)關(guān)節(jié)表面的軟骨，D-Hanks液充分漂洗后用眼科剪剪碎至1mm3大小，移至小錐形瓶中，加入0.25％的胰蛋白酶溶液于37℃攪拌消化15 min。1 200 r/min離心5min，去上清液，后加入0.2％Ⅱ型膠原酶5mL，置磁力攪拌器上37℃消化45 min。過(guò)濾，離心，吸棄上清，加入10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液混勻終止消化，并把細(xì)胞懸液稀釋成（2～3）×105個(gè)/mL，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置CO2培養(yǎng)箱里常規(guī)原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)（溫度37℃，飽和濕度，5％CO2，95％空氣），用于RT-PCR檢測(cè)［7］。

免疫組化檢測(cè)軟骨細(xì)胞增殖 行5μm厚的切片，常規(guī)脫蠟入水，雙蒸水、PBS洗5 min×3次；20μg/mL蛋白酶K37℃消化15 min，PBS沖洗5 min×3次；3％ H2O2-甲醇中25 min，PBS沖洗5 min×3次，加入一抗（鼠抗人PCNA）37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次，加入二抗（生物素IgG）及鏈霉素-生物素-過(guò)氧化酶溶液30 min，PBS沖洗5 min×3次，SABC（1∶100）30min，PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，中性樹膠封片。顯微鏡下計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占比例（增殖陽(yáng)性細(xì)胞黃色），隨機(jī)檢驗(yàn)10～15個(gè)視野，至少計(jì)數(shù)2 500個(gè)軟骨細(xì)胞，算出增殖指數(shù)（增殖指數(shù)＝增殖率×100）。

TUNEL法檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡 行5μm厚的切片，常規(guī)脫蠟入水，20μg/mL蛋白酶 K37℃消化15min，3％H2O2-甲醇中25 min，TUNEL反應(yīng)混合液中37℃90min，5％羊血清室溫封閉20 min，POD37℃孵育30min，堿性磷酸酶染色，中性樹膠封片。算出凋亡指數(shù)（即每張切片選取5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者）最多的高倍視野（×400），計(jì)算500個(gè)腺泡細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比）。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用 t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 免疫組化檢測(cè)軟骨細(xì)胞增殖 統(tǒng)計(jì)分析可知健骨伸筋湯高劑量組、低劑量組和壯骨關(guān)節(jié)丸組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明健骨伸筋湯高劑量、低劑量和壯骨關(guān)節(jié)丸對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨有修復(fù)作用；健骨伸筋湯高劑量組、低劑量組和壯骨關(guān)節(jié)丸組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明健骨伸筋湯高劑量組、低劑量組治療效果優(yōu)于壯骨關(guān)節(jié)丸組；健骨伸筋湯高劑量組和低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明健骨伸筋湯高劑量組治療效果優(yōu)于低劑量組（見表1）。

3.2 TUNEL法檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡 凋亡的軟骨細(xì)胞核呈棕黃色，主要分布在軟骨的淺層和中層?？瞻讓?duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)最低，健骨伸筋湯高劑量組、低劑量組和壯骨關(guān)節(jié)丸組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明健骨伸筋湯高劑量、低劑量和壯骨關(guān)節(jié)丸較好的抑制了軟骨細(xì)胞的凋亡；健骨伸筋湯高劑量組、低劑量組和壯骨關(guān)節(jié)丸組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明健骨伸筋湯高劑量組、低劑量組抑制軟骨細(xì)胞凋亡效果優(yōu)于壯骨關(guān)節(jié)丸組；健骨伸筋湯高劑量組和低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明健骨伸筋湯高劑量組抑制軟骨細(xì)胞凋亡效果優(yōu)于低劑量組（見表2）。

表1 健骨伸筋湯對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞增殖指數(shù)的影響（±s，n＝5）

表1 健骨伸筋湯對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞增殖指數(shù)的影響（±s，n＝5）

注：與模型組比較，＃P＜0.01；與壯骨關(guān)節(jié)丸組比較，△P＜0.05；與健骨伸筋湯低劑量組比較，▲P＜0.05

組別 增殖指數(shù)正常組 24.70±0.26模型組 17.78±1.87壯骨關(guān)節(jié)丸組 20.57±1.67＃健骨伸筋湯低劑量組 24.32±2.42＃△健骨伸筋湯高劑量組 33.13±2.42?！鳌?/p>

表2 TUNEL法檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s，n＝5）

表2 TUNEL法檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s，n＝5）

注：與模型組比較，＃P＜0.05；與壯骨關(guān)節(jié)丸組比較，△P＜0.05；與健骨伸筋湯低劑量組比較，▲P＜0.05

組別 凋亡指數(shù)正常組 3.70±0.26模型組 31.78±1.87壯骨關(guān)節(jié)丸組 21.57±1.67＃健骨伸筋湯低劑量組 19.32±2.42?！鹘」巧旖顪邉┝拷M 17.13±2.42＃△▲

4 討論

骨關(guān)節(jié)炎是一種臨床常見的老年人關(guān)節(jié)的退行性病變，發(fā)病率與年齡密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)膝骨關(guān)節(jié)炎流行病學(xué)［8］表明，65歲以上患有此病的女性和男性分別高達(dá)90％和80％。健骨伸筋湯包括五加皮、獨(dú)活、威靈仙、蒼術(shù)等中藥，可舒筋活絡(luò)，化濕通絡(luò)，川芎、乳香、沒(méi)藥、紅花、川牛膝、當(dāng)歸、赤芍強(qiáng)筋骨、祛瘀通經(jīng)、消腫生肌；白芷、荊芥、防風(fēng)祛風(fēng)固表，溫通散寒；木香、川烏頭、草烏頭行氣止痛、消腫生肌，而上藥熏洗、熱敷，溫通更有利于舒筋通絡(luò)、溫經(jīng)止痛、強(qiáng)壯筋骨的功效，臨床上能夠有效改善關(guān)節(jié)活動(dòng)度，促進(jìn)關(guān)節(jié)功能康復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，健骨伸筋湯方含藥血清各濃度組的軟骨細(xì)胞增殖指數(shù)值明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明其能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增生；而軟骨細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明其具有抑制軟骨細(xì)胞的異常凋亡的功效。

軟骨損傷屬于中醫(yī)筋骨損傷范疇，現(xiàn)代研究認(rèn)識(shí)到軟骨細(xì)胞損傷，特別是軟骨細(xì)胞凋亡與增殖平衡紊亂是其主要機(jī)制［9］。對(duì)KOA的研究應(yīng)從膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞著手，因?yàn)榫S持細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定的重要條件是正常的軟骨細(xì)胞，KOA關(guān)節(jié)軟骨退變的關(guān)鍵因素是細(xì)胞凋亡。軟骨組織工程主要著手點(diǎn)是體外大量擴(kuò)增種子細(xì)胞，然后種植到合適的生物支架中，對(duì)支架進(jìn)行塑形，修復(fù)缺損。這就決定了軟骨組織工程的三大要素是種子細(xì)胞、生物支架和生長(zhǎng)因子［10］。為了給軟骨組織工程的臨床應(yīng)用提供充足的種子細(xì)胞需盡可能開發(fā)新的、能夠有效促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖并有效保持細(xì)胞表型的藥物［11-12］。

本課題重點(diǎn)從軟骨細(xì)胞凋亡與增殖的角度去探討，經(jīng)本2組實(shí)驗(yàn)結(jié)果研究表明：健骨伸筋湯具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖的功效，還可以抑制軟骨細(xì)胞異常凋亡，從而起到防治骨關(guān)節(jié)炎的作用。

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Effects of Jiangu Shenjin decoction on cell proliferation and apoptosis of rat's knee joint chondrocyte

LIU Hongbo1，JING Chunying1*，XIE Yiqiang1，HAN Ping2
（1.Institute of Traditional Chinese Medicine，Hainan Medical University，Haikou 571199，China；
2.The Affiliated Hospital to Hainan Medical University，Haikou 570102，China）

Objective To explore the effects of Jiangu Shenjin decoction on the cell proliferation and apoptosis of rat's chondrocyte.Methods By using improved Hulth method molding，after building 2 weeks，the blank control group and model group applying normal saline lavage；The control group using strong bone joints pill to lavage；Treatmentgroup using low and high concentration of Chinese traditionalmedicine to lavage respectively.On the 13 weeks executed，through immunohistochemistry and TUNELmethod to detect cartilage cell proliferation and apoptosis.Explain Jiangu Shenjin decoction can prevented and treatmentofosteoarthritis by adjust the cartilage cell proliferation and apoptosis.Results The increased index of all dosage of Jiangu Shenjin decoction were significantly higher than control group and molding group（P＜0.05），and the apoptosis rate of chondrocytewas significantly lower than control group andmolding group（P＜0.05）.Conclusion Jiangu Shenjin decoction can improve the cell proliferation activity and obstruct the abnormal apoptosis of chondrocyte，so as to prevent osteoarthritis from happening.

Jiangu Shenjin decoction；rat；chondrocyte of knee joint；proliferation and apoptosis

book=238,ebook=24

R285.5

A

2095－6258（2015）02－0238－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2015.02.007

輯：張海洋

2014－10－17）

海南省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（Hjkj2011-29）。

劉洪波（1978－），男，碩士研究生，講師，主要從事中醫(yī)骨傷科學(xué)研究。