張樂石 李志方 劉力學(xué) 薛偉寧 樊雙義

基礎(chǔ)研究論著

內(nèi)嗎啡肽在大鼠視網(wǎng)膜上的表達(dá)

張樂石 李志方 劉力學(xué) 薛偉寧 樊雙義

目的 探討內(nèi)嗎啡肽在視網(wǎng)膜的分布，內(nèi)嗎啡肽和μ阿片受體在視網(wǎng)膜的共存關(guān)系。方法 成年雄性SD大鼠12只，分為2組，一組為正常對照組（n＝6），另一組建立高眼壓模型（高眼壓模型組，n＝6）。運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法觀察內(nèi)嗎啡肽1（EM-1）、內(nèi)嗎啡肽2（EM-2）和μ阿片受體在視網(wǎng)膜中的分布和共存，并利用高眼壓模型觀察高眼壓對EM-2在視網(wǎng)膜表達(dá)的影響。結(jié)果視網(wǎng)膜無EM-1分布；EM-2主要分布于視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層；EM-2與NeuN、μ阿片受體在視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層共存；高眼壓模型大鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層內(nèi)單位面積表達(dá)EM-2的細(xì)胞數(shù)明顯少于正常大鼠（0.8± 0.1個(gè)／mm3vs.4.6±0.8個(gè)／mm3），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.88，P＜0.05）。結(jié)論 EM-2分布在視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層，與μ阿片受體共存，在高眼壓狀態(tài)下，EM-2的表達(dá)減少。

內(nèi)嗎啡肽；視網(wǎng)膜；高眼壓；分布

內(nèi)嗎啡肽是內(nèi)源性阿片肽家族的一個(gè)成員，是1997年Zadina等［1］在牛腦中發(fā)現(xiàn)，對μ阿片受體具有高選擇性的、強(qiáng)效的內(nèi)源性配體。內(nèi)嗎啡肽是一個(gè)四肽，氨基酸殘基序列為Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 或Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2，分別命名為內(nèi)嗎啡肽1 （EM-1）和內(nèi)嗎啡肽2（EM-2）［2］。內(nèi)嗎啡肽在鎮(zhèn)痛、心血管功能調(diào)節(jié)、呼吸功能調(diào)節(jié)以及消化功能調(diào)節(jié)都具有一定的作用，近期有文獻(xiàn)報(bào)道在腸神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)內(nèi)嗎啡肽能神經(jīng)元的分布，但內(nèi)嗎啡肽在視網(wǎng)膜的分布尚未見報(bào)道。脊椎動(dòng)物的視網(wǎng)膜是一個(gè)復(fù)雜的、具有重要感知功能的組織，鈣結(jié)合蛋白D-28k、鈣視網(wǎng)膜蛋白、一氧化氮合酶等表達(dá)于哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜，近期有文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)源性阿片肽家族的另一成員——腦啡肽在視網(wǎng)膜有表達(dá)，并與感光關(guān)系密切［3］。本文擬研究內(nèi)嗎啡肽在視網(wǎng)膜的分布，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

材料與方法

一、材料

成年雄性SD大鼠12只，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分為2組，每組6只大鼠，一組為正常對照組，另一組建立高眼壓模型。藥品與試劑：兔抗EM-1多克隆抗體（1∶200 Abcam）；兔抗EM-2多克隆抗體（1∶200 Abcam）；小鼠抗NeuN多克隆抗體（1∶500 millipore）；生物素標(biāo)記的驢抗兔多克隆抗體（1∶500 chemion）；Alexa594標(biāo)記的羊抗小鼠多克隆抗體（1∶500 Invitrogen）；FITC標(biāo)記的生物素（1∶1 000 Vector）。

二、方法

1.麻醉及高眼壓模型建立

大鼠經(jīng)7%水合氯醛（0.4 ml／kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，利多卡因滴眼。以一次性輸液器連接4.5號針頭經(jīng)角膜緣刺入前房，接500 ml生理鹽水，距大鼠垂直距離為1.5 m，保持60 min。右眼以針頭刺穿行假手術(shù)。7 d后處死取材。

2.取 材

25%烏拉坦（1ml／kg）腹腔注射麻醉，開胸經(jīng)左心室穿刺入升主動(dòng)脈，先灌入200 ml 0.01 mol／L PBS沖凈血液，再用含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液（PB）500 ml灌注固定，取雙側(cè)眼球，放入上述溶液后固定24 h。

3.染 色

用恒冷箱切片機(jī)對眼球進(jìn)行冠狀位冰凍切片，片厚12 μm，隔2張取1張，切片立即貼于經(jīng)載膠處理的載玻片上。第1組第1套切片用于EM-1／EM-2單標(biāo)記的免疫組織化學(xué)染色，步驟如下：①兔抗EM-1多克隆抗體（1∶200 Abcam）／兔抗EM-2多克隆抗體（1∶200 Abcam）4℃孵育72h；②加入Biotin標(biāo)記的驢抗兔多克隆抗體（1∶200，Millipore），室溫孵育4 h；③加入ABC復(fù)合物（1∶200，Vector），室溫孵育2 h，DAB呈色10 min。將經(jīng)過上述處理的切片室溫干燥后用中性樹膠封片，使用明視野顯微鏡觀察。

第1組第2套、第2組第1套切片用于EM-2／MOR雙標(biāo)的免疫熒光組織化學(xué)染色，步驟如下：①兔抗EM-2多克隆抗體＋小鼠抗MOR（1∶200，Abcam）4℃孵育72 h；②生物素標(biāo)記的驢抗兔多克隆抗體（1∶500 chemion）＋Alexa594標(biāo)記的羊抗小鼠多克隆抗體（1∶500 Invitrogen），室溫孵育4 h；③FITC標(biāo)記的生物素（1∶1 000 Vector），室溫孵育2 h。

第1組第3套、第2組第2套切片用于EM-2／NeuN雙標(biāo)的免疫熒光組織化學(xué)染色，步驟如下：①兔抗EM-2多克隆抗體＋小鼠抗NeuN多克隆抗體（1∶500，Millipore）4℃孵育72 h；②生物素標(biāo)記的驢抗兔多克隆抗體（1∶500 chemion）＋Alexa594標(biāo)記的羊抗小鼠多克隆抗體（1∶500 Invitrogen），室溫孵育4 h；③FITC標(biāo)記的生物素（1∶1 000 Vector），室溫孵育2 h。

上述各步驟之間均用0.01 mol／L的PBS （pH7.3）洗片3次，每次10 min。所有上述一抗和二抗均用含5%驢血清、0.3%Triton X2100、0.25%角叉菜膠和0.05%疊氮化鈉的0.01 mol／L PBS（pH7.3）稀釋。將經(jīng)過上述處理的切片經(jīng)室溫干燥，以2.5%三乙烯二胺和等量甘油的混合液封片，激光掃描共聚焦顯微鏡（FV1000，Olympus）觀察。同時(shí)以正常羊血清代替一抗孵育第2套切片，其余染色步驟與上相同進(jìn)行陰性對照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均為陰性。

4.細(xì)胞計(jì)數(shù)

每個(gè)標(biāo)本取5個(gè)獨(dú)立視野（×600），計(jì)算每個(gè)獨(dú)立視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值作為該標(biāo)本單位面積內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、內(nèi)嗎啡肽在正常大鼠視網(wǎng)膜上的分布

免疫組織化學(xué)染色顯示，未見EM-1陽性產(chǎn)物在視網(wǎng)膜上的分布（圖1A，×20），EM-2陽性產(chǎn)物分布在視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層（GCL）神經(jīng)細(xì)胞胞體［圖1 B（×20）、C（×100）］，且EM-2與NeuN（圖2）、μ阿片受體（圖3）在視網(wǎng)膜上的共存。

二、內(nèi)嗎啡肽在高眼壓模型大鼠視網(wǎng)膜上的分布

對大鼠眼前房行高眼壓處理后，視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層水腫且結(jié)構(gòu)松散，行NeuN染色見神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量無明顯減少，而在EM-2在視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層的表達(dá)減少（圖4）。正常大鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層單位面積EM-2陽性細(xì)胞數(shù)平均為4.6±0.8個(gè)／mm3，高眼壓模型大鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層單位面積EM-2陽性細(xì)胞數(shù)平均為0.8±0.1個(gè)／mm3（表1）。高眼壓模型大鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層內(nèi)單位面積表達(dá)EM-2的細(xì)胞數(shù)明顯少于正常大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.88，P＜0.05）。

圖1 EM-1、EM-2陽性產(chǎn)物在小鼠視網(wǎng)膜上的分布

圖2 EM-2免疫陽性產(chǎn)物與NeuN在小鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層的共存

表1 高眼壓組和正常對照組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層EM-2陽性細(xì)胞數(shù)（±s，n＝6）

表1 高眼壓組和正常對照組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層EM-2陽性細(xì)胞數(shù)（±s，n＝6）

組 別大鼠1大鼠2大鼠3大鼠4大鼠5大鼠6高眼壓組0.6±0.10.2±0.11.3±0.20.7±0.10.8±0.21.2±0.1正常對照組7.2±1.23.9±0.85.4±0.55.0±1.52.2±0.33.9±0.6

圖3 EM-2免疫陽性產(chǎn)物與μ阿片受體在小鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層的共存

圖4 高眼壓處理后7 d的小鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層

討 論

內(nèi)嗎啡肽主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，與μ阿片受體分布相似，但EM-1和EM-2的分布并不相同。EM-1在腦部的分布比EM-2密集而廣泛，主要分布于孤束核、臂旁核、隔區(qū)、斜角帶、終紋床核、韁核、丘腦腹后內(nèi)側(cè)核、下丘腦后核、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）、藍(lán)斑、伏核、杏仁核及運(yùn)動(dòng)性語言中樞等部位；EM-2在脊髓的分布比EM-1更為廣泛，主要分布于脊髓背角的小直徑初級傳入神經(jīng)、脊髓背角淺神經(jīng)層、背根及三叉神經(jīng)脊束核。它也出現(xiàn)于腦中富有阿片受體的區(qū)域：伏核、丘腦中央中核、隔區(qū)、下丘腦和杏仁核、藍(lán)斑和PAG，但在大腦皮質(zhì)、紋狀體、海馬、孤束核和背根神經(jīng)節(jié)上分布很少［4］。EM-2樣免疫反應(yīng)纖維和膨體在脊髓膠狀質(zhì)和邊緣系統(tǒng)的分布與腦啡肽、強(qiáng)啡肽相似，與P物質(zhì)則共存于三叉神經(jīng)脊束核，從而提示它在痛覺調(diào)節(jié)中起重要作用［5］。EM-1及EM-2于在體實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用［6］。

研究結(jié)果顯示，在視網(wǎng)膜上只有EM-2表達(dá)，無EM-1表達(dá)，EM-2陽性神經(jīng)元分布在節(jié)細(xì)胞層，且與神經(jīng)元特異性標(biāo)記NeuN及μ阿片受體共存。視網(wǎng)膜內(nèi)的細(xì)胞根據(jù)其形態(tài)、功能不同，分為無長突細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞、節(jié)細(xì)胞、感光細(xì)胞等。根據(jù)視網(wǎng)膜內(nèi)EM-2陽性神經(jīng)元的形態(tài)可判定其屬于節(jié)細(xì)胞。

在高眼壓模型大鼠視網(wǎng)膜上，EM-2陽性細(xì)胞的表達(dá)明顯減少，提示EM-2在青光眼的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用。

致視網(wǎng)膜損傷的病理基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的進(jìn)行性死亡。臨床研究結(jié)果證實(shí)，盡管許多青光眼患者的眼壓已得到控制，但視野和視神經(jīng)損害仍繼續(xù)發(fā)展，有時(shí)將導(dǎo)致視力完全喪失［7］。既往研究顯示，內(nèi)源性阿片肽對神經(jīng)細(xì)胞、心肌缺血具有保護(hù)作用，當(dāng)心肌缺血時(shí)，心臟通過自身分泌或者旁分泌內(nèi)源性阿片肽，并作用于心肌上的阿片受體，發(fā)揮重要的心肌保護(hù)作用［8-9］。阿片受體激動(dòng)劑通過改善神經(jīng)細(xì)胞供血、減輕細(xì)胞水腫、降低TNF-α表達(dá)、減輕炎癥反應(yīng)等途徑起到缺血保護(hù)作用［10-11］。內(nèi)源性阿片肽可激活磷酸肌醇3-激酶通路、減少氧自由基形成、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡［12］。而在高眼壓模型上視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層的EM-2表達(dá)減少，提示內(nèi)源性阿片肽在視網(wǎng)膜上可能起到缺血保護(hù)的作用，EM-2的表達(dá)減少是高眼壓造成視網(wǎng)膜持續(xù)性損害的可能機(jī)制。進(jìn)行外源性阿片肽預(yù)處理可能能夠減輕高眼壓對視網(wǎng)膜的持續(xù)損害，但需要進(jìn)一步研究證明。

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Expression of endomorphins in the retina of rat

Zhang Leshi，Li Zhifang，Liu Lixue，Xue Weining，F(xiàn)an Shuangyi.Department of Neurology，Affiliated Hospital of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China Corresponding author，Zhang Leshi，E-mail：zlsfmmu＠163.com

Objective To investigate the distribution of endomorphins（EM）in the retina，and assess the coexistence of EM and μ-opioid receptor in the retina.Methods Twelve Sprague Dawley（SD）rats were divided into the control（n＝6）and intraocular hypertension model groups（n＝6）.Immunohistochemistry was used to detect the expression and coexistence of EM-1，EM-2 and μ-opioid receptor in the rat retina，and evaluate the influence of intraocular hypertension upon the expression of EM-2.Results EM-1 was not expressed in the retina.EM-2 was mainly distributed in the retinal ganglion cell layer.EM-2，NeuN and μopioid receptor coexisted in the retinal ganglion cell layer.The density of cells expressing EM-2 in the intraocular hypertension model group was（0.8±0.1）／mm3，significantly lower compared with（4.6±0.8）／mm3in the control group（t＝3.88，P＜0.05）.Conclusions EM-2 was expressed in the retinal ganglion cell layer and coexisted with μ-opioid receptor.The expression of EM-2 was decreased under intraocular hypertension.

Endomorphins；Retina；Intraocular hypertension；Distribution

2014-12-11）

（本文編輯：楊江瑜）

10.3969／g.issn.0253-9802.2015.04.005

100071北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

，張樂石，E-mail：zlsfmmu＠163.com