馬曉梅，趙 輝*

淀粉酶產(chǎn)生菌MSP13篩選及其產(chǎn)酶條件初步優(yōu)化

馬曉梅，趙 輝*

（黑龍江大學生命科學學院，農(nóng)業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150080）

從優(yōu)質(zhì)白酒窖泥中分離篩選出13株產(chǎn)淀粉酶的兼性厭氧細菌，通過測定α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和脫支酶酶活力，最終篩選出一株生產(chǎn)4種淀粉酶活力均相對較高的菌株，并對其進行形態(tài)觀察，生理生化指標和16S rDNA鑒定，確定該菌株為解淀粉芽孢桿菌，并將其命名為MSP13。對菌株MSP13產(chǎn)酶條件進行初步優(yōu)化，確定其產(chǎn)酶的較佳條件是：CaCl2質(zhì)量濃度0.15 g/L、MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度0.3 g/L，pH 5.5和溫度37℃。優(yōu)化后的菌株MSP13生產(chǎn)4種酶的酶活力平均提高了31.645%。

淀粉酶；窖泥；鑒定；篩選；白酒

白酒是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，因其獨特的釀造工藝及其呈現(xiàn)的特殊風味，在世界酒類產(chǎn) 品中別具一格[1]。在傳統(tǒng)固態(tài)濃香型白酒發(fā)酵中，窖泥是白酒風味形成的基礎，長期的工藝操作使窖泥富集了種類繁多、功能各異的益于釀酒的微生物菌群[2-8]。中國濃香型白酒的生產(chǎn)基礎是泥窖窖池，窖 泥中的微生物在發(fā)酵過程中起著舉足輕重的作用[9]。要產(chǎn)好酒，就必須有優(yōu)質(zhì)的窖池，而優(yōu)質(zhì)的窖池其本質(zhì)在于窖泥，優(yōu)質(zhì)的窖泥能產(chǎn)生香氣，可大幅度提高白酒的檔次[10]。窖泥中多種霉菌、酵母菌和細菌，是生產(chǎn)商品酶、多糖和抗生素等的主要發(fā)酵微生物[11]。在白酒生產(chǎn)中，淀粉酶起著液化和糖化的作用，是白酒出酒率的重要保證。因此通過篩選窖泥中高活力淀粉酶菌株，并應用于白酒發(fā)酵，將會明顯提高白酒的出酒率。

從1963年起，日本研究者三田利用白曲霉（Aspergillus candidus Link）生產(chǎn)出一種酸性淀粉酶，適用于燒酒制備中淀粉原料的加工[12]。龍茜萍等[13]從貴州某酒廠大曲中分離得到一株產(chǎn)糖化酶活力較高的菌株，鑒定該菌株為黑曲霉（Aspergillus niger），該菌株可應用于白酒大曲的強化和處理酒糟；謝建華等[14]從南寧酒廠附近土壤中篩選到一株產(chǎn)淀粉酶的野生菌株GXBA-4，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefacien）；Rohban等[15]在伊朗高鹽度湖泊中分離出49個極端嗜鹽微生物，可產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶等多種酶，并且鑒定了菌屬；Norashirene[16]從馬來西亞溫泉中篩選出11株產(chǎn)淀粉酶的嗜熱菌，經(jīng)鑒定這些菌株為分枝桿菌屬。張文麗等[17]從吉林某豆制品加工廠污水排放口處的土樣中，分離篩選得到一株高產(chǎn)糖化酶的黑曲霉（Aspergillus niger）。近幾年許多學者分別從富含淀粉的土壤樣品、海洋泥中和污水排放口處的土樣中，都篩選出產(chǎn)淀粉酶的菌株，并對其進行了鑒定[18-24]。

淀粉水解酶系是影響淀粉轉化率及出酒率的主要因素[25]。α-淀粉酶為內(nèi)切型水解酶，可以隨機內(nèi)切淀粉鏈的α-1,4糖苷鍵，產(chǎn)物為小分子糖和短鏈糊精的混合物[26]。β-淀粉酶是外切型水解酶，能從淀粉鏈的非還原性末端順次切下一分子麥芽糖[27]。葡萄糖淀粉酶也是一種外切型水解酶，它從淀粉鏈的非還原末端順序切開α-1,4-糖苷鍵生成一分子葡萄糖[28]。因此α-淀粉酶為β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶提供充足的淀粉鏈非還原末端，β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶將其水解為可發(fā)酵的糖類。淀粉脫支酶同α-淀粉酶和β-淀粉酶等水解酶不同，其作用對象為α-1,6-糖苷鍵，但它不能直接降解淀粉，只有當α-淀粉酶作用后才降解支鏈淀粉[29]。因此在白酒發(fā)酵過程中，只有在4種酶的共同作用下，才能使谷物中的直鏈和支鏈淀粉更好地被降解，從而提高出酒率。

本實驗選取東北寒區(qū)優(yōu)質(zhì)老窖窖泥，利用五點取樣法，從窖泥中分離、篩選高產(chǎn)淀粉酶（α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、脫支酶）的細菌，以期篩選生產(chǎn)4種酶活性均較高的菌株，并對篩選出的菌株進行鑒定。細菌產(chǎn)4種淀粉酶的調(diào)控基因不同[26-28,30]，其水解機制也不相同，但4種酶在最適溫度、最適pH值及對金屬離子的需求上有很大相似之處[31-34]，因此優(yōu)化最適的酶活性條件，以期提高4種淀粉酶的活力，使4種酶在一個最適的條件下協(xié)同作用，從而提高白酒發(fā)酵的原料利用率和出酒率。

1 材料與方法

1.1材料、試劑與培養(yǎng)基

窖泥來自黑龍江省富裕老窖酒業(yè)有限公司的優(yōu)質(zhì)老窖池。

DL15000 DNA Marker、細菌基因組DNA試劑盒生工生物工程（上海）股份有限公司；可溶性淀粉、支鏈淀粉哈爾濱寶信生物科技有限公司。

分離和保藏培養(yǎng)基：可溶性淀粉2 g、牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2，固體加入15～20 g瓊脂，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、可溶性淀粉5 g、Na2HPO40.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 5 g、CaCl20.2 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設備

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀德國Biometra公司；DGGE電泳儀美國Bio-Rad公司；UV755B紫外分光光度計、FA1004電子天平上海精密科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品采集

依據(jù)生態(tài)學原理，采用五點法對酒廠的優(yōu)質(zhì)窖池中的窖泥進行采集。取樣自上而下，按4層分別采取，同一層面按中心部和周邊部五點取樣，并混合均勻作為1個樣品，在室溫下進行采樣，記好標記，無菌密封，4℃冰箱保存。

1.3.2產(chǎn)淀粉酶菌株的初篩

稱取窖泥1 g，放入盛有99 mL滅菌分離培養(yǎng)基的三角燒瓶中，靜止培養(yǎng)24 h，吸取富集菌液0.5 mL，進行不同濃度梯度稀釋，分別取0.1 mL涂布于分離培養(yǎng)基上，每個梯度做3個平行樣，37℃倒置恒溫培養(yǎng)24 h，用滅菌的牙簽挑選單菌落，分別影印接種于2個新的分離平板，篩選出的菌落用盧戈氏碘液染色，產(chǎn)透明圈的為目的菌株。根據(jù)其菌落形態(tài)不同進行簡單歸類，并進行純化保藏。

1.3.3高產(chǎn)淀粉酶菌株的復篩

測定初篩菌株的淀粉酶活力進行復篩。用發(fā)酵培養(yǎng)基對目的菌株進行培養(yǎng)，分別測定α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和脫支酶的活力。

脫支酶活力單位定義為在45℃、pH 6.8條件下，1 min內(nèi)水解支鏈淀粉產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量；α-淀酚酶與β-淀粉酶活力單位定義為在40℃、pH 5.6條件下，1 min內(nèi)水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量；糖化酶活力單位定義為在30℃、pH 4.6條件下，1 min內(nèi)水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量。4種酶活力均采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法確定[17,35-37]。

1.3.4菌株形態(tài)學及生理生化鑒定

參照《伯杰細菌鑒定手冊》[38]，對篩選出高淀粉酶活力的菌株進行形態(tài)學描述和生理生化鑒定。生理生化鑒定包括：甲基紅實驗、乙酰甲基甲醇實驗、檸檬酸鹽利用實驗、多種糖發(fā)酵實驗、好氧性實驗、明膠液化實驗、脲酶實驗、蛋白胨水解實驗、硫化氫實驗、硝酸鹽還原實驗和過氧化氫實驗等，每個實驗重復3次[38-39]。

1.3.5菌株16S rDNA鑒定

1.3.5.1提取細菌基因組DNA

16S rDNA通用引物設計如下：正向引物8F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物1512R：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

1.3.5.2 PCR擴增反應體系和程序

PCR擴增反應體系：10×PCR Buffer緩沖液2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，正向引物與反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，去離子水17.3 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，總計25 μL。

PCR擴增反應程序：94℃變性5 min，94℃變性0.5 min，56℃退火1 min，72℃延伸2 min，32個循環(huán)，72℃終延伸8 min，4℃保存。

1.3.5.3目的片段與載體連接

用TaKaKa連接試劑盒將回收產(chǎn)物連接至pMD19-T載體上，4℃反應過夜，利用質(zhì)粒提取試劑盒將載體與DNA片段進行連接，連接目的產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，保存重組陽性克隆，并進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，再次進行PCR 擴增。

1.3.5.4 16S rDNA片段的測序與系統(tǒng)發(fā)育分析

將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。再將測序所得到的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析，通過MEGA軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6菌株MSP13生長曲線和淀粉酶活力的研究

將菌株MSP13進行培養(yǎng)，每2 h測定該菌的生長曲線和淀粉酶總酶活力，確定菌株MSP13的最佳培養(yǎng)時間。

1.3.7產(chǎn)淀粉酶條件的優(yōu)化

將篩選出的菌株MSP13進行初步的產(chǎn)酶條件優(yōu)化。培養(yǎng)基中CaCl2質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.5 g/L；MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.5、0.6 g/L；pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0；溫度分別為28、31、35、37、39℃；按照上述條件每次只改變一個變量，5%的接種量，靜止培養(yǎng)24 h后，測定菌液的淀粉酶活力，得到CaCl2和MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度、溫度和pH值與淀粉酶活力的關系。再利用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進行淀粉酶的生產(chǎn)，分別測定α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和脫支酶的酶活力。

2 結果與分析

2.1高產(chǎn)淀粉酶細菌的分離篩選

初篩共獲得53株菌株，根據(jù)透明圈大小比較，選出其中的13株菌株產(chǎn)淀粉酶的酶活力見表1。由表1可知，菌株MSP13的α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和脫支酶的酶活力相對較高，分別為9.679、31.258、17.372、26.981 U/mL。因此確定MSP13作為后續(xù)進一步研究的菌株。

表1 13株菌所產(chǎn)4種酶的酶活力比較Table 1 Comparison of four enzyme activities from 13 strains

2.2菌株的鑒定

2.2.1篩選菌株的形態(tài)學觀察及生理生化鑒定

對菌株MSP13進行形態(tài)學觀察和生理生化鑒定，結果見表2和表3，從表中結果可初步鑒定菌株MSP13為芽孢桿菌屬。

表2 菌株MSP13的形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of MSP13

表3 菌株MSP13的生理生化實驗結果Table 3 Physiological and biochemical tests of MSP13

2.2.2菌株MSP13的16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

以菌株MSP13的基因組為模板，經(jīng)PCR擴增，電泳檢測，在1 000～2 000 bp處有一明亮的特征條帶（圖1）。

圖1 菌株MSP13的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳分析Fig.1 Electrophoresis of PCR-amplified products of 16S rDNA from MSP13

經(jīng)測序，菌株MSP13的16S rDNA序列長1 439 bp，與GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析，利用DNAMAN軟件繪制菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2。結合形態(tài)學觀察和生理生化分析，可以確定菌株MSP13為解淀粉芽孢桿菌。

圖2 菌株MSP13系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of MSP13

2.3菌株MSP13產(chǎn)淀粉酶條件的優(yōu)化

2.3.1菌株MSP13的生長與淀粉酶合成規(guī)律

圖3 菌株MSP13的生長曲線與產(chǎn)酶曲線Fig.3 Growth curve and enzyme-producing curve of MSP13

從圖3可知，菌株MSP13的遲緩期為2～4 h，對數(shù)期為4～14 h，穩(wěn)定期為14～18 h，衰亡期為18～24 h；同時18 h時酶活力較高，所以確定該菌株最佳培養(yǎng)時間為18 h。

2.3.2溫度對菌株MSP13產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響

溫度對MSP13菌株產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響見圖4，在37℃時菌株MSP13所產(chǎn)淀粉酶的酶活力最大。

圖4 溫度對菌株MSP13產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the production of amylase from MSP13

2.3.3 pH值對菌株MSP13產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響

pH值對菌株MSP13產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響見圖5，pH值為5.5時菌株MSP13所產(chǎn)淀粉酶的酶活力最高。

圖5 pH值對菌株MSP13產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on the production of amylase from MSP13

2.3.4 CaCl2和MgSO4·7H2O對菌株MSP13產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響

CaCl2和MgSO4·7H2O對菌株MSP13產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響見圖6，確定CaCl2質(zhì)量濃度為0.15 g/L、MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.3 g/L時菌株MSP13產(chǎn)淀粉酶的酶活力最高。

圖6 aCl2和MgSOMgSO4·7H7H2O對菌株MSP13產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響Fig.6 Effect of calcium and magnesium ions on the production of amylase from MSP13

用優(yōu)化后的培養(yǎng)基（牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、可溶性淀粉5 g/L、Na2HPO40.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、NaCl 5 g/L、CaCl20.15 g/L，pH 5.5）進行37℃培養(yǎng)，測定菌株MSP13的α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、脫支酶的酶活力分別為16.31、45.02、25.17、36.72 U/mL，4種酶活力平均提高了31.645%。

3 結 論

本實驗從優(yōu)質(zhì)白酒窖泥中篩選出α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和脫支酶活力均較高的菌株，并經(jīng)形態(tài)學、生理生化和16S rDNA鑒定，確定該菌株為解淀粉芽孢桿菌，并將其命名為MSP13，對該菌株的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行了初步優(yōu)化，確定該菌的最適培養(yǎng)溫度為37℃，最適pH值為5.5，最佳CaCl2質(zhì)量濃度為0.15 g/L，最佳MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.3 g/L。優(yōu)化后的α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和脫支酶活力分別為16.31、45.02、25.17、36.72 U/mL，優(yōu)化后4種酶活力平均提高了31.645%。

解淀粉芽孢桿菌在自然界中分布十分廣泛，能夠?qū)Χ喾N真菌與細菌產(chǎn)生抑制作用[40-43]，王奕文等[44]從不同甜瓜表面分離到1株解淀粉芽孢桿菌，對灰葡萄孢、鏈格孢、尖孢鐮刀菌、黑曲霉和粉紅單端孢等8種果蔬病原真菌有顯著且廣譜的拮抗作用。張淑梅等[45]從大豆中篩選到解淀粉芽孢桿菌TF2，證明其對大豆根腐病菌具有較強抑制作用。解淀粉芽孢桿菌也從動物糞便及腸道中分離得到，并將其作為益生菌添加劑添加到動物飼料中，有較好抑制致病菌的效果。Castro等[46]研究了解淀粉芽孢桿菌MIR-41產(chǎn)淀粉酶、普魯蘭酶和葡萄糖苷酶的情況。本實驗選取東北寒區(qū)優(yōu)質(zhì)老窖窖泥，從窖泥中分離篩選出了產(chǎn)α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、脫支酶4種酶活性均較高的解淀粉芽孢桿菌MSP13，該菌株來源于白酒窖泥，能適應白酒發(fā)酵環(huán)境，若應用于白酒發(fā)酵，在4種淀粉酶的協(xié)同作用下，可以大幅度提高淀粉的出酒率，對于白酒企業(yè)有很實際的應用價值。

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Screening of Amylase-Producing Strain MSP13 and Optimization of Fermentation Conditions

MA Xiaomei, ZHAO Hui*
(Agricultural Microbiology Engineering Research Center, Ministry of Education, College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, China)

Totally 13 strains of facultative anaerobic bacteria that can produce amylase were isolated from a highquality liquor pit mud. One strain was screened by determining the activities of α-amylase, β-amylase, glucoamylase and debranching enzyme. Through morphological observation, physiological and biochemical tests and molecular biological methods, the screened strain was identifi ed as Bacillus amyloliquefaciens and named as MSP13. Furthermore, the culture conditions for amylase production were optimized to be 0.15 g/L CaCl2, 0.3 g/L MgSO4·7H2O, pH 5.5 and 37℃.This strain under the optimal conditions could improve the four enzyme activities by 31.645% on average.

amylase; liquor pit mud; identifi cation; screening; liquor

Q815

A

10.7506/spkx1002-6630-201511034

2014-12-03

黑龍江省博士后科研啟動基金項目（LBH-Q13139）

馬曉梅（1987—），女，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：759948123@qq.com

*通信作者：趙輝（1971—），男，副教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：zhaohui9463@sohu.com