胡明華 袁憲宇 吳長(zhǎng)初 朱 喜

（1長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)和組織胚胎學(xué)教研室，長(zhǎng)沙410219；2中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院健康管理科，長(zhǎng)沙410013）

CD34是人體內(nèi)一種常見(jiàn)的高糖基化分子，其分子表面存在許多糖修飾表位，根據(jù)糖修飾表位的不同［1］，CD34被分成I型、Ⅱ型、Ⅲ型。CD34在臨床上已經(jīng)被證實(shí)為造血干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，同時(shí)，CD34還在許多成體干細(xì)胞中表達(dá)。CD34可參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘連，具有不同的生物學(xué)功能及生物學(xué)結(jié)構(gòu)活性，可廣泛分布在大多數(shù)白細(xì)胞、紅細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中。表皮組織具有強(qiáng)大的修復(fù)能力，主要是由于表皮干細(xì)胞的作用，但由于表皮干細(xì)胞缺乏特異性的CD分子標(biāo)志物［2］，因此，尋找一種與表皮干細(xì)胞密切相關(guān)的標(biāo)志物則十分重要。本研究采用組織學(xué)觀察法、雙免疫標(biāo)記法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人包皮、頭皮和軀干皮膚來(lái)源的組織標(biāo)本中CD34蛋白表達(dá)，探討CD34蛋白作為表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物的可行性。

材料和方法

1.材料

分別選取2013年1月至2014年1月在我院泌尿外科進(jìn)行包皮環(huán)切術(shù)患者包皮組織標(biāo)本60份，其中20份供者年齡＜20歲，20份供者年齡20－40歲，20份供者年齡40歲以上。選取同時(shí)期健康者頭皮和軀干皮膚來(lái)源的組織標(biāo)本各60份，頭皮組織和軀干皮膚均來(lái)源于自愿者，均簽署知情同意書(shū)。

2.方法

2.1 CD34免疫組織化學(xué)

組織標(biāo)本均制成1 cm×0.5 cm的皮片，在4%多聚甲醛中進(jìn)行固定，過(guò)夜后對(duì)組織進(jìn)行梯度脫水，再用石蠟包埋，切片，厚度為5μm。首先將石蠟切片浸于一抗（CD34∶1∶50）中孵育，4℃過(guò)夜，使用PBS進(jìn)行漂洗，室溫平衡20 min，加入酶標(biāo)抗兔／鼠聚合物孵育，室溫30 min，DAB顯色，蘇木素進(jìn)行復(fù)染，乙醇進(jìn)行梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，在普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。采用SP法測(cè)定組織細(xì)胞中CD34，兔抗人CD33單克隆抗體有北京金橋生物公司提供?？瞻讓?duì)照：使用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，結(jié)果提示陰性；使用己知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果提示陽(yáng)性，其他步驟與實(shí)驗(yàn)標(biāo)本相同。結(jié)果觀察：CD34組織著色棕色為陽(yáng)性。

2.2 免疫雙標(biāo)記

體外分離培養(yǎng)包皮基底層細(xì)胞，分別在原代，3代，6代時(shí)，進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記染色檢測(cè)。細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗，將培養(yǎng)基成分充分去除，加入4%中性多聚甲醛固定20 min；PBS充分漂洗，10%正常山羊血清進(jìn)行封閉，后加入一抗（CD34各表位BI.3C5，QBend，581，B，整合素，p63），4℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗，加入anti.Mouse IgG／Dy Light488（1：200），anti.Rabbit IgG／Dy Light594，室溫下孵育2 d；PBS漂洗，熒光顯微鏡下觀察各蛋白的表達(dá)情況。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)

皮膚組織修整為l cm×0.5 cm大小的皮片。并按照上述分離富集表皮基底層細(xì)胞的方法獲取表皮基底層細(xì)胞。獲得細(xì)胞分別與CD34的三種表型p63或者β1整合素進(jìn)行孵育，含BSA的PBS漂洗后，加入FITC.conjugated goat anti.mouseIgG（BD Pharmingen）作為二抗。用PBS溶液代替一抗，其他步驟相同作為空白對(duì)照。經(jīng)流氏檢測(cè)，記錄各表位的陽(yáng)性率。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS19.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.CD34蛋白的表達(dá)

CD34蛋白在人包皮和頭皮的表皮基底層細(xì)胞中有表達(dá)，而在人軀干皮膚的表皮中無(wú)表達(dá)。并且，在同一組織內(nèi)，不同表位的CD34蛋白的表達(dá)也不均衡。Ⅰ型表位CD34蛋白的分布比Ⅱ、Ⅲ型表位CD34蛋白更加廣泛（圖1）。A1提示CD34主要表達(dá)在頭皮及包皮的表皮基底層細(xì)胞，A2提示在軀干皮表皮中未發(fā)現(xiàn)CD34各表位的表達(dá)。細(xì)胞的子細(xì)胞CD34陽(yáng)性的細(xì)胞在表皮中的分布與表皮干細(xì)胞的分布基本相同，均主要在表皮突的底部。

圖1 CD34各表位在頭皮、包皮、軀干皮的分布情況。標(biāo)尺＝50μmFig.1 CD34 epitope distribution in each scalp，foreskin，the skin of the trunk.Bar＝50μm

2.CD34陽(yáng)性細(xì)胞與ESCs特征性標(biāo)記表達(dá)情況

利用β1整合素或是p63對(duì)分離的基底層細(xì)胞進(jìn)行分選能夠獲得ESCs，CD34陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)p63或者β1整合素，并且CD34三種表位在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中的表達(dá)隨著細(xì)胞傳代而減少。CD34陽(yáng)性細(xì)胞、p63、β1整合素在原代及3代細(xì)胞中均存在表達(dá)，且與傳代陽(yáng)性數(shù)目呈負(fù)相關(guān)性。

3.不同年齡CD34的表達(dá)情況

CD34I型表位陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于II型和III型（P＜0.05），不同年齡組的CD34各表位之間比較，陽(yáng)性率無(wú)明顯差異（P＞0.05，表1）。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同年齡CD34不同表位的表達(dá)（±s）Table 1 FCM different ages different epitopes CD34 expression（±s）

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同年齡CD34不同表位的表達(dá)（±s）Table 1 FCM different ages different epitopes CD34 expression（±s）

年齡（歲）Age（years）例數(shù)Cases CD34表位（CD34 epitope）Ⅰ型（Ⅰtype） Ⅱ型（Ⅱtype） Ⅲ型（Ⅲtype）＜20 20 35.04±2.41 8.92±0.30 20.63±1.12 20－40 20 35.49±2.67 9.27±0.90 20.48±0.81＞40 20 35.39±2.01 9.32±1.24 20.68±1.12

討 論

ESCs（胚胎干細(xì)胞）是皮膚自我修復(fù)及自我更新的關(guān)鍵，部分潛在的ESCs標(biāo)記可分離ESCs與角質(zhì)細(xì)胞。部分研究顯示，ESCs重點(diǎn)分布在表皮突的深嵴部，CD34各個(gè)表位的陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)也分布于表皮突的底部，分布于嵴間的略可見(jiàn)少許散在表達(dá)的CD34細(xì)胞，因此，在表皮分布區(qū)，可見(jiàn)到分布特征類(lèi)似的ESCs與CD34。選用CD34蛋白作為篩選ESCs的潛在表面標(biāo)記具有以下幾種優(yōu)點(diǎn)：一是皮膚可以不斷的進(jìn)行自我更新；二是ESCs的數(shù)量不會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而減少；三是ESCs在環(huán)境刺激又到下發(fā)生轉(zhuǎn)分化的能力不會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而變?nèi)酢?/p>

表皮干細(xì)胞主要存在于表皮細(xì)胞的表皮突底部，在皮膚受到損傷時(shí)，能夠起到重要的自我修復(fù)作用［4］。而在研究中發(fā)現(xiàn)［5］，表皮干細(xì)胞的表面無(wú)特異性的CD分子標(biāo)志物，傳統(tǒng)的研究中，主要使用β1整合素以及p63作為表皮干細(xì)胞的分選標(biāo)記［7］。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，表皮細(xì)胞中的CD34陽(yáng)性細(xì)胞存在于表皮的表皮突底部，與表皮干細(xì)胞的分布十分相似。研究發(fā)現(xiàn)［8］，CD34陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)存在β1整合素和p63的表達(dá)，因此，CD34陽(yáng)性細(xì)胞有可能作為表皮干細(xì)胞分選的標(biāo)志物。但CD34陽(yáng)性細(xì)胞僅存在在于頭皮和包皮的基底層細(xì)胞中，而在軀干皮的基底層細(xì)胞中無(wú)表達(dá)，因此，其僅可能用于分選頭皮和包皮的表皮干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CD34蛋白在表皮內(nèi)的含量并不會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而減少，作為分選表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物，CD34蛋白更加穩(wěn)定。在頭皮和包皮的表皮干細(xì)胞分選中，CD34蛋白是更加理想的分選標(biāo)志物。

但在某些實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的CD34檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)結(jié)果存在嚴(yán)重差異，整合以往的資料，存在此種現(xiàn)象的原因可能分別以下幾種：（1）早期的實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行單一的Ⅱ型表位檢測(cè)，因此在同時(shí)進(jìn)行CD34的多種表位，可以更加清晰的表述CD34的表達(dá)狀態(tài)；（2）檢測(cè)部位的不同可能導(dǎo)致結(jié)論不同；（3）不同的實(shí)驗(yàn)室可能采取的實(shí)驗(yàn)方法存在差異，因此導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。針對(duì)上述情況，試驗(yàn)中我們選取了不同解剖部位的皮膚進(jìn)行CD34表位的表達(dá)情況的研究，可以找出早期實(shí)驗(yàn)中存在差異結(jié)果的原因。

綜上所述，CD34陽(yáng)性分子與表皮干細(xì)胞在頭皮和包皮的表皮基底層細(xì)胞中有十分相似的分布，可以作為頭皮和包皮中表皮干細(xì)胞分選的標(biāo)志物，但其還需要不斷深入的研究，同時(shí)，ESCs具備多向分化的能力，且其自身多潛能的能力仍然在不斷發(fā)展，因此，在未來(lái)的研究中，ESCs將會(huì)更多的應(yīng)用于臨床與動(dòng)物疾病模型中。

［1］牛云飛，路衛(wèi)，夏照帆等.表皮干細(xì)胞在人體不同部位皮膚的分布差異.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25（9）：959－961

［2］Aniket S.Wadajkar；Sonia Santimano；Liping Tang，et al.Magnetic－based multi－layer microparticles for endothelial progenitor cell isolation，enrichment，and detachment.Biomaterials，2014，35（2）：654－663

［3］劉愛(ài)軍，黃錦桃，李海標(biāo).胚胎干細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞對(duì)小鼠全層皮膚缺損的修復(fù).解剖學(xué)報(bào)，2007，38（3）：296－299

［4］Jiang S，Zhao L，Purandare B，et al.Differential expression ofstem cell markers in human fo licular bulge and interfollicular epidermal compartments.Histochem Cell Biol，2010，133（4）：455－465

［5］Kai－Hong J，Jun X，Kai－Meng H，et al.P63 expression pattern during rat epidermis morphogenesis and the role of p63 as a marker for epidermal stem cells.J Cutan Pathol，2007，34（6）：154－159

［6］林吉茂，卿素珠，成醒民等.山羊胚胎皮膚的發(fā)育及β1整合素在發(fā)育中的表達(dá).中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，2（37）：7337－7340

［7］黃培信，劉德伍，王肖蓉等.不同發(fā)育階段人皮膚表皮干細(xì)胞增殖分化相關(guān)基因的表達(dá)特征.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13（23）：4442－4446