馬敬儀，董金香

(長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117)

銀杏葉軟膠囊中銀杏黃酮醇苷和內(nèi)酯含量測定

馬敬儀，董金香

(長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117)

目的 建立高效液相色譜法檢測銀杏葉軟膠囊中銀杏黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯含量。方法 采用Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×200 mm， 5 μm)，甲醇-0.4%磷酸溶液(55：45)作為流動相，檢測波長為360 nm；柱溫40 ℃；流速1 mL·min-1。結(jié)果 槲皮素、山柰素和異鼠李素分別在5.212～52.124，4.729～47.291，2.217～22.166 μg·mL-1范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系；其中白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、B、C分別在1.307～6.535，1.008～5.040，0.935～4.675，0.629～3.145 μg范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系；總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯的平均回收率分別為99.87%和99.60%，RSD分別為2.94%和4.24%。結(jié)論 高效液相色譜法檢測銀杏葉軟膠囊中總黃酮醇苷和萜類內(nèi)酯操作簡單，且靈敏度和穩(wěn)定性高，可作為銀杏葉軟膠囊質(zhì)量控制的方法之一。

銀杏葉軟膠囊；黃酮醇苷；萜類內(nèi)酯；色譜法；高效液相

銀杏葉軟膠囊是由銀杏葉提取物制備的膠囊制劑，具有軟化和擴(kuò)張血管、抑制血小板活化因子、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂和降血壓等功效[1-2]，對急性腦梗死、高脂血癥、高血壓冠心病以及腦供血不足等心腦血管疾病具有很好的療效[3-4]。其主要有效成分是銀杏黃酮醇苷和萜類內(nèi)酯。但是銀杏葉軟膠囊中成分較為復(fù)雜，分析方法較為繁瑣、復(fù)雜或不穩(wěn)定[5]。本研究建立高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法檢測銀杏葉軟膠囊中銀杏黃酮醇苷和萜類內(nèi)酯，旨在為銀杏葉軟膠囊質(zhì)量控制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜儀為美國Agilent 1100型系列，包括四元梯度泵、手動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器和Agilent 100工作站。

1.2 試藥 槲皮素對照品(批號：100081-200907)、山柰素對照品(批號：110861-200808)、異鼠李素對照品(批號：110860-200608)、白果內(nèi)酯對照品(批號：110865-200605)、銀杏內(nèi)酯A對照品(批號：110862-200608)、銀杏內(nèi)酯B對照品(批號：110863-200508)、銀杏內(nèi)酯C對照品(批號：110864-200505)均購自中國食品藥品檢定研究院；銀杏葉軟膠囊(石家莊市華新藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：210437，210409，210587)；甲醇等色譜試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為二次純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×200 mm， 5 μm)；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液(55：45)用醋酸調(diào)整pH=3.0；檢測波長360 nm；柱溫40 ℃；流速1 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL(定量環(huán))。

2.2 對照品溶液配制 分別取槲皮素、山柰素、異鼠李素各4.51，5.24和2.82 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶，甲醇溶液溶解并定容，配制成0.045 1，0.052 4，0.028 2 mg·mL-1的總黃酮醇苷混合對照品貯備液，備用。分別取白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、B、C對照品各為10.70，8.05，8.16，4.32 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶，甲醇溶液溶解并定容，配制成濃度0.107 0，0.080 5，0.081 6，0.043 2 mg·mL-1的混合對照品貯備液，備用。

2.3 供試品溶液配制 取銀杏葉軟膠囊內(nèi)容物1 g，精密稱定，置于10 mL量瓶，采用甲醇-0.4%磷酸溶液(55：45)溶解并定容，然后將樣品采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回流處理30 min，迅速冷卻，過濾后將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，并用甲醇-0.4%磷酸溶液(55：45)定容，樣品作為供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液配制 根據(jù)銀杏葉軟膠囊制作工藝制作缺少銀杏葉提取物的膠囊樣品，根據(jù)“2.3”項供試品溶液制作方法制備陰性對照溶液。

2.5 專屬性分析 分別吸取總黃酮醇苷混合對照品溶液、總萜類內(nèi)酯混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按照“2.1”項色譜條件測定。結(jié)果見圖1和圖2。陰性對照溶液未見槲皮素、山柰素、異鼠李素等總黃酮醇苷和白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、B、C等總萜類內(nèi)酯。而在供試品溶液中，在各組分保留時間處可見色譜峰，且專屬性良好。

2.6 總黃酮醇苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取總黃酮醇苷混合對照品貯備液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，按照上述條件進(jìn)行檢測，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)做線性回歸。測得總黃酮醇苷各組分的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見表1。

A.陰性對照溶液；B.總黃酮醇苷混合對照品；C.供試品溶液；1.槲皮素； 2.山柰素； 3.異鼠李素

圖1 3種溶液中黃酮醇苷各組分HPLC色譜圖

A.陰性對照溶液；B.總萜類內(nèi)酯混合對照品；C.供試品溶液；1.白果內(nèi)酯； 2.銀杏內(nèi)酯A； 3.銀杏內(nèi)酯B； 4.銀杏內(nèi)酯C

圖2 3種溶液總萜類內(nèi)酯各組分HPLC色譜圖

表1 3種總黃酮醇苷和4種總萜類內(nèi)酯的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

組分回歸方程相關(guān)系數(shù)(r)線性范圍/(μg·mL-1)槲皮素Y=42.73X-32.580.9995.212^52.124山奈素Y=41.13X-27.440.9994.729^47.291異鼠李素Y=32.84X-18.430.9992.217^22.166白果內(nèi)酯Y=0.712X-4.0110.9991.307^6.535銀杏內(nèi)酯AY=0.652X-3.4260.9991.008^5.040銀杏內(nèi)酯BY=0.831X-4.6850.9990.935^4.675銀杏內(nèi)酯CY=0.617X-3.8340.9750.629^3.145

2.7 總萜類內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取總萜類內(nèi)酯混合對照品溶液各3，6，9，12，15 μL，按照上述條件進(jìn)行檢測，以進(jìn)樣量的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，峰面積積分值的對數(shù)值作為縱坐標(biāo)做線性回歸。測得萜類酯各組分的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見表1。

2.8 精密度分析 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 20 μL，采用上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果測得槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為0.37%，0.25%和0.15%，而白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、B、C的峰面積RSD分別為0.98%，0.71%，1.21%和0.83%。

2.9 穩(wěn)定性分析 分別在0， 2， 4， 8， 16，24 h不同時間點取同一批制備的供試溶液20 μL，按照“2.1”項色譜條件測定銀杏葉軟膠囊中總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯各組分的峰面積。結(jié)果供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，槲皮素，山柰素，異鼠李素峰面積RSD分別為0.37%，0.25%和0.15%，而白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、B、C的峰面積RSD分別為0.98%，0.71%，1.21%和0.83%。

2.10 重復(fù)性分析 取同一批號的銀杏葉軟膠囊，稱取6份，按照“2.3”的樣品處理方法，制備銀杏葉軟膠囊供試品溶液，然后按照“2.1”色譜條件測定總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯峰面積的一致性，結(jié)果表明槲皮素，山柰素，異鼠李素的峰面積RSD分別為0.43%，0.60%和0.91%。而白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、B、C的峰面積RSD分別為1.04 %，0.92%，1.58%和0.99%。

2.11 加樣回收率分析 分別精密稱取已知總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯準(zhǔn)確含量的銀杏葉軟膠囊(批號：210437)6份，每份約0.2 g，同時精準(zhǔn)加入總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別為2.591，0.211 mg·mL-1的混合對照品溶液1 mL，按“2.3”項下方法處理樣品，并按照“2.1”色譜條件進(jìn)行總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯測定，并計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 銀杏葉軟膠囊中黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯加樣回收率實驗結(jié)果 n=6

2.12 樣品測定 分別將不同批次的銀杏葉軟膠囊按照“2.3”的操作方法配制成測試樣品溶液，采用“2.1”色譜條件檢測總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯的峰面積，計算每批次中總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯的含量以及RSD。結(jié)果見表3。

3 討論

總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯是銀杏葉軟膠囊中2種

主要有效成分，可以用總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯的含量來分析不同批次藥物的質(zhì)量。本研究建立HPLC法測定銀杏葉軟膠囊中總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯HPLC。

表3 不同批次銀杏葉軟膠囊中總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯的含量分析 n=3

在色譜柱的選擇方面， Diamonsil C18色譜柱對總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯具有較好分離效果。《中華人民共和國藥典》2005年版規(guī)定對總黃酮苷元的檢測分析，流動相選擇甲醇-0.4%的磷酸溶液，但是對于兩種溶液的比例沒有固定的數(shù)值。流動相對色譜峰的分離度影響很大，在實驗前對流動相組成的比例進(jìn)行預(yù)實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醇和0.4%磷酸溶液比例達(dá)到55：45時，各色譜峰分離度好，峰形尖銳且保留時間適中。

采用對總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯對照品溶液在波長200～400 nm掃描，發(fā)現(xiàn)槲皮素、山柰素、異鼠李素白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、B、C等有效成分在360 nm有較高的吸收峰。因此本研究將色譜檢測波長選擇為360 nm。

本研究建立的HPLC法檢測銀杏葉軟膠囊中總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性良好，方法簡單，且檢測準(zhǔn)確，穩(wěn)定性良好，數(shù)據(jù)可靠。

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2014-02-12

2014-05-05

馬敬儀(1989-)，女，吉林長春人，碩士，研究方向：中藥藥劑。電話：(0)13578725716，E-mail：qqqkkk10@163.com。

董金香(1963-)，女，吉林長春人，教授，博士，研究方向：中藥藥劑。電話：(0)13578882375，E-mail：838329276@qq.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)10-1370-03

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.029