孫志亞，何 靜，陳民佳，趙宗林

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所細(xì)胞生物治療中心消化內(nèi)科，重慶 400042)

·技術(shù)與方法·

不同組合CD3、CD28抗體對(duì)CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的探索研究

孫志亞，何 靜△，陳民佳，趙宗林

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所細(xì)胞生物治療中心消化內(nèi)科，重慶 400042)

目的 探索利用CD3、CD28抗體對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)體外激活轉(zhuǎn)化增強(qiáng)作用，采用不同包被方法及抗體濃度，以期獲得一種更有效的包被方法。方法利用人外周血單個(gè)核細(xì)胞分離技術(shù)、體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)(FMC)，以CD3抗體固相包被、CD28抗體不同濃度固相包被或懸浮加入，計(jì)算經(jīng)12 d培養(yǎng)獲得成熟CIK細(xì)胞的數(shù)量，測(cè)定不同包被方法刺激培養(yǎng)后的細(xì)胞表型的變化。結(jié)果培養(yǎng)后C組中CD4+細(xì)胞百分比明顯低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組中CD8+細(xì)胞所占比例高于A、B組(P<0.05)。C組的T4/T8比值與A、B組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組NK細(xì)胞含量與C組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CD25+細(xì)胞在C組中所占比例低于A組(P<0.01)。結(jié)論CD3抗體固相包被及CD28抗體懸浮加入組合對(duì)人外周血細(xì)胞的刺激增強(qiáng)作用強(qiáng)于CD3抗體固相包被CD28+抗體固相包被組合。

流式細(xì)胞術(shù)；CIK細(xì)胞；固相包被

早在1999年就有研究利用CD3、CD28抗體體外擴(kuò)增活化T淋巴細(xì)胞，激活表型為CD8+CD25+的具有殺傷活性的細(xì)胞，回輸?shù)矫庖吡Φ拖碌哪[瘤患者體內(nèi)，從而提高腫瘤患者的生命質(zhì)量，延長壽命[1]。CIK細(xì)胞是從外周血中分離出的單個(gè)核細(xì)胞，在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子刺激、培養(yǎng)后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞群，將其轉(zhuǎn)入宿主體內(nèi)建立長期的特異性抗腫瘤免疫效應(yīng)，具有很好的應(yīng)用前景[2]。本研究利用CD3、CD28抗體對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)體外擴(kuò)增轉(zhuǎn)化增強(qiáng)作用，采用不同包被方法及抗體濃度，相互比較，探索一種更有效的包被方法。

1 材料與方法

1.1 材料 人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?；12孔板、6孔板(NUNC公司，美國)；AB血漿由重慶市血液中心提供；CD3、CD28抗體(Invitrogen公司)；白細(xì)胞介素2(IL-2)(北京四環(huán)制藥有限公司)；白細(xì)胞介素7(IL-7)等細(xì)胞因子(Invitrogen公司)；GT-T551培養(yǎng)基(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；3111 型CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司,美國)；A2型生物安全柜(Thermo公司，美國)；流式細(xì)胞儀(美國貝克曼HPC-100)。

1.2 方法 (1)抗體包被：取12孔板，分3組包被：A組抗體CD3濃度2 mg/L、CD28濃度2 mg/L；B組抗體CD3濃度2 mg/L、CD28濃度5 mg/L；C組抗體CD3濃度5 mg/L。分A、B、C3組包被，每組8孔重復(fù)，每孔250 μL包被液。室溫靜置3 h，4 ℃保存?zhèn)溆谩?2)取同一腫瘤患者外周血50 mL，利用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞[2]，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照1×106個(gè)/孔重懸于1號(hào)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基GT-T551中加入人干擾素γ(γ-IFN)100萬IU/L、IL-2 100萬IU/L、 IL-1β 100萬IU/L、 IL-7 40 μg /L)中，并接種于去除包被有抗體CD3、CD28 的16孔中；同樣按照1×106個(gè)/孔重懸于2號(hào)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基GT-T551中加入γ-IFN 100萬 IU /L、IL-2 100萬 IU /L、 IL-1β 100萬 IU /L、 IL-7 40 μg /L、抗體CD28 50 μg/L)中，并接種于去除單獨(dú)包被有抗體CD3 的8孔中。均加入10%AB血漿，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(3)培養(yǎng)至第5天，將各孔細(xì)胞重懸，接種于6孔板中。每孔分別補(bǔ)加3號(hào)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基GT-T551中加入IL-2 100萬 IU /L、IL-1β 100萬 IU /L、IL-7 40 μg /L)3 mL，并加入10%AB血漿，37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。(4)培養(yǎng)至第7天，將6孔板中各孔細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25 cm2的培養(yǎng)瓶中，每瓶補(bǔ)加12 mL 4號(hào)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基GT-T551中加入IL-2 100萬 IU /L)，并加入10%AB血漿，37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(5)每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，培養(yǎng)至12 d收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取樣檢測(cè)細(xì)胞分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism-4.0軟件包處理，進(jìn)行多組間One-Way ANOVA Test，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組細(xì)胞的生長狀態(tài)與培養(yǎng)至第12天收集的細(xì)胞數(shù)量比較 顯微鏡下觀察可見紅細(xì)胞逐漸退化，第3天開始細(xì)胞由圓形逐漸變?yōu)椴灰?guī)則形態(tài)，且體積變大，呈聚集態(tài)生長。第7天細(xì)胞鋪滿平板，細(xì)胞逐漸均一化。第12天細(xì)胞成熟，呈圓形，單個(gè)細(xì)胞飽滿透亮，見圖1。

A：第0天；B：第3天；C：第7天；D：第12天。

圖1 細(xì)胞生長狀態(tài)(×100)

2.2 12 d后淋巴細(xì)胞數(shù)量變化及活率 經(jīng)過12 d誘導(dǎo)培養(yǎng)后，3組細(xì)胞數(shù)量迅速擴(kuò)增，其中C組達(dá)到(0.66±0.03)×108個(gè),顯著高于A組[(0.58±0.04)×108個(gè)，P<0.05]，較B組[(0.61±0.02)×108個(gè)]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組細(xì)胞經(jīng)過12 d培養(yǎng)后，細(xì)胞活率均達(dá)到97%以上，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

*：P<0.05，C組與A組比較。

圖2 T4細(xì)胞比例

*：P<0.05，與C組比較。A：C組T8細(xì)胞流式檢測(cè)；B：T8細(xì)胞比例。

圖3 T8細(xì)胞

2.3 誘導(dǎo)PBMC后流式分析 抗體誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，3組細(xì)胞總成熟的T細(xì)胞百分比均達(dá)到90%以上，但3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)后C組中CD4+細(xì)胞百分比明顯低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。而C組中CD8+細(xì)胞所占比例高于前兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。T4/T8比值作為CIK細(xì)胞的重要指標(biāo)，C組明顯低于前兩組，且與A組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與B組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

經(jīng)流式檢測(cè)，CIK細(xì)胞中含有部分NK細(xì)胞，但所占比例不高，B組與C組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。具有免疫抑制功能的CD25+細(xì)胞在C組中所占比例低于A組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。

*：P<0.05，B組與C組比較。

圖4 NK細(xì)胞比例

*：P<0.01，A組與C組比較。

圖5 CD3+CD25+細(xì)胞比例

3 討 論

T細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用。它不僅有直接的免疫功能，而且能夠產(chǎn)生多種細(xì)胞因子及表達(dá)黏附分子等，與其他的免疫細(xì)胞共同作用發(fā)揮強(qiáng)大的免疫共調(diào)節(jié)作用。目前國內(nèi)外已將體外誘導(dǎo)活化的T淋巴細(xì)胞用于過繼性免疫治療[3-4]。

本試驗(yàn)比較了相同濃度CD3固相包被與不同濃度CD28固相包被及懸浮加入刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)后CIK細(xì)胞的生長狀態(tài)、增殖能力、細(xì)胞表型。試驗(yàn)結(jié)果表明：CD28抗體懸浮加入培養(yǎng)的CIK 細(xì)胞經(jīng)流式檢測(cè)CD4+、CD3+CD25+均明顯低于CD28抗體固相包被方式培養(yǎng)的CIK細(xì)胞，而前者中的CD8+細(xì)胞比例卻高于后者，CD3固相包被、CD28懸浮加入的效果比CD3固相包被、CD28固相包被的效果好。鏡下觀察外周血單個(gè)核細(xì)胞在細(xì)胞因子的刺激誘導(dǎo)下，細(xì)胞迅速增殖，形態(tài)發(fā)生改變，呈聚集生長并逐漸均一化，培養(yǎng)至12 d成熟，細(xì)胞透亮飽滿，與之前研究報(bào)道相一致[5]。

CD3抗體刺激T細(xì)胞活化(即包被)，原理是固相結(jié)合的高密度CD3抗體可引起T細(xì)胞TCR-CD3復(fù)合體的交聯(lián)，產(chǎn)生活化信號(hào)，刺激T細(xì)胞活化增殖。研究證實(shí)，液相單一加入CD3單抗在不同濃度下均不能刺激單個(gè)核細(xì)胞增殖[6-7]，故本試驗(yàn)中使用CD3單抗固相包被。CD3單抗包被濃度依據(jù)細(xì)胞生長的需要來選擇[8]。常用包被抗體濃度是5 mg/L，高濃度可以快速刺激T細(xì)胞活化增殖，但活化誘導(dǎo)的凋亡作用(AICD)也很明顯。結(jié)合臨床CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，本試驗(yàn)中CD3單抗包被濃度分別選擇了2 mg/L及5 mg/L。細(xì)胞12 d誘導(dǎo)成熟，未見明顯凋亡現(xiàn)象，且5 mg/L組效果優(yōu)于2 mg/L組。

近年來，對(duì)T細(xì)胞活化的研究已從單一分子機(jī)制發(fā)展到多分子的綜合研究[9-10]。CD28分子已充分被證實(shí)是經(jīng)由TCR/CD3激活T細(xì)胞的重要共刺激分子，在TCR被抗CD3單抗預(yù)激活的細(xì)胞中，當(dāng)CD28與其配體結(jié)合后，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸磷酸化，使T細(xì)胞充分活化[1]。研究證實(shí)CD28單抗呈非劑量依賴型，當(dāng)采用10 μg/L低劑量時(shí)即可協(xié)同CD3引起較強(qiáng)的擴(kuò)增效果，在100 μg/L時(shí)達(dá)到高峰[11]。本試驗(yàn)中CD28單抗也采用了固相包被與液相加入兩種方法。為避免高濃度引起細(xì)胞凋亡，故CD28單抗液相加入濃度采用50 μg/L，結(jié)果證實(shí)CD28單抗液相加入效果明顯優(yōu)于固相包被，具體原理有待深入研究。本研究將進(jìn)一步研究不同時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞的增殖速度計(jì)數(shù)量變化，從而為臨床培養(yǎng)CIK細(xì)胞提供了一種可參考的方法。

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The effect of monoclonal antibody coated with anti-human CD3 and CD28 on CIK cells growth

SunZhiya,HeJing△,ChenMinjia,ZhaoZonglin

(CellBiologicalCenter,DepartmentofGastroenterology,DapingHospital,ResearchInstituteofSurery,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042，China)

Objective To explore the enhancing effect of monoclonal antibody coated with anti-human CD3 and CD28 on activation and transformation of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) in vitro.MethodsHuman peripheral blood mononuclear cells were separated.Cells was cultured in vitro,and determined by flow cytometry.The solid phase with CD3 and CD28 antibody was coated and added in.The mature CIK cells were obtained after 12 days culturing.ResultsThe CD4+cells was lower in group C than those in group A(P<0.05).The CD8+cells was higher in group C than that in group A and B(P<0.05).There was significant difference of T4/T8 between group C and group A and B(P<0.05).There was significant difference of NK cells between group B and group C(P<0.05).The CD25+cells was lower in group C than that in group A (P<0.01).ConclusionCD3 antibody solid coated combined with CD28 antibody added to the suspension has more strong activation than both CD3 antibody and CD28 antibody solid coating on peripheral blood mononuclear cell.

flow cytometry;CIK cell;immobilization on solid phase materials

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.22.026

孫志亞(1982-)，助理研究員，碩士，從事腫瘤細(xì)胞免疫治療研究?！?/p>

，E-mail:hejingwang@126.com。

R-331

A

1671-8348(2015)22-3096-03

2015-02-18

2015-07-09)