王 奎， 周景文， 李江華*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

大腸桿菌araE基因?qū)Φ湫捅奖仡惢衔镛D(zhuǎn)運(yùn)過程的影響

王 奎1，2， 周景文1，2， 李江華*1，2

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

為了研究阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對大腸桿菌轉(zhuǎn)運(yùn)典型苯丙類素化合物的能力，采用基因過量表達(dá)和基因沉默技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行控制，從而研究AraE對苯丙類素化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)過程機(jī)制。同時，用定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平考察并驗證了araE基因的過量表達(dá)水平和基因抑制程度。通過測定菌體的生長動力學(xué)參數(shù)，衡量菌體對典型苯丙素類化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。結(jié)果表明，大腸桿菌araE基因只參與了大腸桿菌對白藜蘆醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，對其他種類的苯丙素類化合物作用不明顯。

araE；大腸桿菌；苯丙素類化合物；基因沉默；定量PCR；轉(zhuǎn)運(yùn)

苯丙素類化合物（phenylpropanoids）是自然界種類最多的多酚類植物次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物界中，目前發(fā)現(xiàn)的種類已超過8 000多種。苯丙素類化合物是天然存在的一類苯環(huán)與三個直鏈碳連接構(gòu)成的酚類化合物，主要包括簡單苯丙素、香豆素、木脂素、木質(zhì)素類和黃酮類[1]。苯丙素類化合物具有廣泛的生理功能。在植物體中，苯丙素類化合物主要參與調(diào)節(jié)植物生長、抵抗紫外傷害、抵抗病毒、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和清除活性氧自由基[2-3]。在生物體內(nèi)，苯丙素類化合物還具有廣泛的藥學(xué)價值，具有較強(qiáng)的抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗病毒、降血糖、抗輻射和降血脂等多種生物學(xué)作用[4-6]。近年來，由于苯丙素類化合物的廣泛應(yīng)用，其市場每年增長30%以上。大部分天然苯丙素類化合物在植物體內(nèi)含量極低，提取法成本高昂且受季節(jié)限制較為嚴(yán)重[7]。此外，由于其具有復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，用化學(xué)方法合成較困難。這些因素導(dǎo)致了市場上的苯丙素類化合物價格較高，部分甚至處于供不應(yīng)求的狀態(tài)[8]。微生物具有生長速度快、適應(yīng)力強(qiáng)、遺傳操作簡單等特點(diǎn)，用微生物法合成苯丙素類化合物已經(jīng)吸引越來越多的科研人員關(guān)注。目前許多研究人員利用釀酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae）和大腸桿菌（Escherichia coli）等為宿主菌進(jìn)行苯丙素類化合物的合成[9-11]。

大腸桿菌作為常用的工程菌，遺傳背景清晰，分子操作技術(shù)完善，是生物技術(shù)生產(chǎn)平臺的首選，很早就有人通過改造大腸桿菌相關(guān)代謝途徑生產(chǎn)苯丙素類化合物[12]。目前通過基因工程、代謝工程等技術(shù)手段已實(shí)現(xiàn)了多種苯丙素類化合物在大腸桿菌中的合成，如柚皮素、白藜蘆醇等[13]。但是由于菌體無法快速地將苯丙素類化合物轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外，造成大量的苯丙素類產(chǎn)物在胞內(nèi)大量積累，對工程菌生長造成毒害作用，極大的限制了產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。因此，特異性或者非特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白對提高產(chǎn)量具有著重要的作用[14]，尤其是單向通道蛋白，可以降低胞內(nèi)積累的苯丙素類化合物的含量，減少菌體的代謝負(fù)擔(dān)，促進(jìn)苯丙素類化合物的合成。

AraE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是由Macpherson等在1981年首次鑒定出來的，最初鑒定的功能是一類阿拉伯糖低親和力高轉(zhuǎn)運(yùn)能力的H+協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。后來的研究發(fā)現(xiàn)，AraE的功能不僅僅局限于轉(zhuǎn)運(yùn)阿拉伯糖，對其他的糖類如半乳糖、木糖、核糖和海藻糖等都有一定的轉(zhuǎn)運(yùn)效果[15]。Yu等在釀酒酵母中表達(dá)大腸桿菌的非特異性阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AraE能夠使白藜蘆醇的產(chǎn)量提高2.44倍[16]。也有研究表明，在釀酒酵母中共同表達(dá)大腸桿菌來源的araE基因和其他來源的TAL、4CL、STS基因能夠使白藜蘆醇的產(chǎn)量從1.27 mg/L提升到3.1 mg/L[17]。在工程菌大腸桿菌（BW27784）中協(xié)同表達(dá)4CL、STS和araE基因，可使白藜蘆醇產(chǎn)量達(dá)到100 mg/L[18]。但是目前還未有阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AraE在大腸桿菌內(nèi)對苯丙素類化合物轉(zhuǎn)運(yùn)能力的報道。AraE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在釀酒酵母中對白藜蘆醇有轉(zhuǎn)運(yùn)作用是因為白藜蘆醇和阿拉伯糖相似都含有多個羥基[16]。作者選取具有相似羥基的兩種苯丙素類化合物蘆丁和柚皮素，用以觀察AraE蛋白對其他種類的苯丙素類化合物是否同樣有轉(zhuǎn)運(yùn)作用。藜蘆醇、蘆丁和柚皮素的結(jié)構(gòu)見圖1。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 大腸桿菌 E.coli BL21（DE3）：宿主菌株；大腸桿菌E.coli JM109：質(zhì)粒構(gòu)建菌株；基因操作所用質(zhì)粒 pMD19-T Simple vector：購自TaKaRa公司；基因表達(dá)所用的質(zhì)粒pRSFDuet-1和pACYCDuet-1：購自Novagen公司。

圖1 所選3種苯丙素類化合物結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of 3 phenylpropanoids

1.1.2 培養(yǎng)基

1）大腸桿菌LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，固體培養(yǎng)基添加瓊脂20 g/L；陽性轉(zhuǎn)化子篩選培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中分別加入500 μg/mL氨芐青霉素 （質(zhì)粒 pMD19-T Simple vector）、340 μg/mL氯霉素 （質(zhì)粒pACYCDuet-1）或100 μg/mL卡那霉素（質(zhì)粒pRSF-PTasRNA）。

2）菌株生長曲線測定培養(yǎng)基：M9培養(yǎng)基（13.3 g/L M9CA Broth，0.2g/dL 葡 萄 糖 ，1 mmol/L MgSO4，0.5 μg/mL Thiamine·HCl，過濾除菌），1.0 g/L蘆丁或者柚皮素或者白藜蘆醇 （DMSO溶解），100 μg/mL卡那霉素或者 340 μg/mL氯霉素，IPTG（0，100，200，400 μmol/L）[19]。

1.1.3 酶、引物、DNA Marker及相關(guān)試劑盒pMD18-T Simple Vector、LATaq、DNA Marker、Solution I連接酶、大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、細(xì)菌總DNA提取試劑盒以及各種內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司。本研究中所用的引物合成和測序工作均由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2 araE過量表達(dá)重組菌的構(gòu)建

以大腸桿菌基因組為模板，引物P1和P2擴(kuò)增獲得araE基因片段，使用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)EcoRI和HindIII，連入具有氯霉素抗性的pACYCDuet-1?；瘜W(xué)法轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21 （DE3），用引物P3和P4進(jìn)行菌落PCR驗證。構(gòu)建好的菌株命名為E.coli BL21（DE3）/pACYC-araE。對照菌株為含有空載體pACYCDueT-1的E.coli BL21，命名為E.coli BL21（pACYC），并進(jìn)行酶切驗證。

1.3 基因沉默菌的構(gòu)建

利用購自Agilent公司的QuikChange II XL定點(diǎn)突變試劑盒將pRSFDuet-1上的XhoI去掉，即將序列CTCGAG突變成序列CTAGAG，突變后的質(zhì)粒命名為pRSFDuet-1（Mut）?；虺聊|(zhì)粒特有的PTasRNA序列包含的trc啟動子、lac操縱子、38 bp末端序列和 stem-loop結(jié)構(gòu)的 rrnB終止子通過GeneScript公司合成[20]。將合成好的PTasRNA序列和pRSFDuet-1（Mut）用內(nèi)切酶PfoI和BamHI雙酶切后所獲得的片段連接即為基因沉默質(zhì)粒，命名為pRSF-PTasRNA。

araE基因的asRNA序列（-40到130 bp）用引物P5和P6，見表1。以E.coli BL21（DE3）基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增。片段進(jìn)行膠回收后與pMD19-T Simple vector連接。將連接體系用化學(xué)轉(zhuǎn)化法的方法轉(zhuǎn)入E.coli JM109感受態(tài)，并用通用引物進(jìn)行菌落PCR驗證。提取陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行基因測序，測序正確質(zhì)粒命名為pMD19-T-ΔaraE。

將 pMD19-T-ΔaraE和 pRSF-PTasRNA用XhoI和NcoI酶進(jìn)行雙酶切，膠回收目的片段和酶切后的質(zhì)粒連接并轉(zhuǎn)化，使用驗證引物P7和P8進(jìn)行菌落PCR驗證。提取連接成功的質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)，構(gòu)建好的菌株命名為E.coli BL21 （DE3）/pRSF-asRNA-araE。對照菌株用含有空載體pRSF-asRNA的E.coli BL21，命名為E.coli BL21（pRSF-asRNA），見圖2。

圖2 沉默質(zhì)粒pRSF-asRNA-araE構(gòu)建過程Fig.2 Construction of silencing araE plasmid pRSF-asRNA-araE

1.4 定量PCR方法

E.coli BL21（DE3）的RNA提取以及cDNA文庫的建立，分別參照天根公司的RNAprep pure Cell/ Bateria Kit和Takara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript○RRT reagent Kit。參照Takara公司的SYBR Premix Ex Taq試劑盒和LightCycler Real Time PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行qPCR反應(yīng)。根據(jù)NCBI公布的araE的基因序列，由Beacon Designer 7.0設(shè)計用于qPCR的引物P9和P10，內(nèi)參基因為16s DNA，引物為P11和P12。按照以下程序進(jìn)行qPCR反應(yīng)：95℃預(yù)變性40 s，95℃變性5 s，57℃延伸30 s，持續(xù)40個循環(huán)，50℃冷卻30 s，每個基因做3次平行以保證數(shù)據(jù)的重復(fù)性。用LightCycler分析絕對定量及相對定量數(shù)據(jù)。

表1 構(gòu)建表達(dá)載體時使用的引物序列Table 1 Oligonucleotides sequence used in vectors construction

1.5 SDS-PAGE

挑取E.coli BL21（pACYC-araE）單菌落接種到含有340 μg/mL氯霉素的M9培養(yǎng)基，30℃、200 r/min活化10 h。按照1%的接種體積分?jǐn)?shù)接種到含有340 μg/mL氯霉素的M9培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)4 h，加入終濃度100 μmol/L的IPTG，誘導(dǎo)4 h。離心收集1 mg菌體，加入60 μL含有Benzonase的裂解液（裂解液需用1×PBS稀釋），30℃、200 r/min振蕩30 min。離心收集沉淀，用裂解液清洗沉淀3次，加入60 μL 20%SDS溶液，用槍頭吹吸充分重懸。離心后取10 μL上清液，加入10 μL上樣緩沖液，99℃加熱10 min。采用12 g/dL分離膠，5 g/dL濃縮膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），鑒定蛋白質(zhì)是否表達(dá)。

1.6 重組菌生長動力學(xué)參數(shù)測定方法

挑取E.coli BL21 （pACYC-araE）或E.coli BL21（pRSF-asRNA-araE）單菌落接種到含有340 μg/mL氯霉素的M9培養(yǎng)基，37℃、200 r/min活化10 h。按照1%的接種體積分?jǐn)?shù)接種到過量表達(dá)菌株生長曲線測定培養(yǎng)基中。將接種后的培養(yǎng)基分裝至96孔板中，每孔200 μL，置于預(yù)熱至30℃的96孔板振蕩器上，900次/min振蕩培養(yǎng)，每隔1小時用酶標(biāo)儀測量OD600直至生長至穩(wěn)定期[21]。將獲得的數(shù)據(jù)通過軟件OriginPro 8.5通過公式擬合得出菌株在不同條件下的最大比生長速率（μmax）[22]。

其中，μmax為最大比生長速率；tmax為μ達(dá)到最大值時的時間；tL為延遲期的時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 araE基因的轉(zhuǎn)錄水平分析

通過對araE基因過量表達(dá)和基因沉默控制阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AraE在細(xì)胞內(nèi)的含量。過量表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而提高蛋白質(zhì)含量?；虺聊峭ㄟ^表達(dá)一段asRNA序列，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄失敗，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量的減少。定量PCR結(jié)果顯示，在100 μmol/L IPTG誘導(dǎo)下，基因沉默導(dǎo)致菌體內(nèi)araE基因mRNA水平下降了10倍，而過量表達(dá)使菌株體內(nèi)araE基因mRNA水平上調(diào)了12倍，見圖3。

圖3 不同菌株araE基因轉(zhuǎn)錄水平定量PCR驗證Fig.3 Relative expression levels of araE gene in different strains

2.2 araE基因過量表達(dá)的SDS-PAGE驗證

對菌株E.coli BL21（pACYC-araE）不可溶性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。圖4顯示，所構(gòu)建的重組菌株E.coli BL21（pACYC-araE）在相對分子質(zhì)量約為47 000處明顯比對照菌表達(dá)量大，與預(yù)期相符，說明AraE蛋白在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了過量表達(dá)。

圖4 AraE在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant AraE in E.coli BL21（DE3）

2.3 araE過量表達(dá)重組菌株對不同種類苯丙素類化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)能力

E.coli BL21（DE3）在M9培養(yǎng)基中的μmax達(dá)到0.52 h-1，添加400 μmol/L IPTG后，μmax下降到0.45 h-1?；蜻^量表達(dá)菌株E.coli BL21（DE3）/pACYC-araE在1.0 g/L蘆丁環(huán)境中，通過不同濃度的IPTG（0、100、200、400 μmol/L）來控制其表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其最大比生長速率分別為0.24、0.21、0.17、0.13 h-1；在1.0 g/L柚皮素的環(huán)境中，其最大比生長速率分別為0.21、0.19、0.17、0.16 h-1；在1.0 g/L白藜蘆醇的環(huán)境中，其最大比生長速率分別為0.13、0.17、0.21、0.29 h-1，見圖5。

圖5 araE過量表達(dá)菌株在不同濃度IPTG誘導(dǎo)后在不同種類苯丙素類化合物刺激下最大比生長速率Fig.5 μmaxof E.coli BL21 （DE3）/pACYC-araE in the 1 g/L rutin，naringenin or resveratrol and induced by different concentrations of IPTG

對過量表達(dá)菌株E.coli BL21（DE3）/pACYC-araE在三種不同物質(zhì)刺激下的生長曲線的研究發(fā)現(xiàn)，隨著IPTG濃度的增加，也即AraE蛋白質(zhì)表達(dá)量的增加，發(fā)現(xiàn)E.coli BL21 （DE3）/pACYC-araE菌株在蘆丁和柚皮素的刺激下的最大比生長速率都略微下降，下降幅度和原始菌株隨著IPTG濃度增加下降的幅度差不多，說明AraE蛋白表達(dá)量的增加對于提高大腸桿菌在蘆丁或者柚皮素的環(huán)境中的生長速率沒有作用，也即說明AraE蛋白對于蘆丁或者柚皮素沒有轉(zhuǎn)運(yùn)作用。但是E.coli BL21（DE3）/pACYC-araE在白藜蘆醇的環(huán)境中隨著IPTG濃度的增加，也即AraE蛋白表達(dá)量的增加，最大比生長速率也增加，說明AraE蛋白能夠有效地提升大腸桿菌在白藜蘆醇中的生長速率，也即AraE蛋白在大腸桿菌中也能轉(zhuǎn)運(yùn)白藜蘆醇。這與先前的研究釀酒酵母中AraE蛋白能夠轉(zhuǎn)運(yùn)白藜蘆醇結(jié)果相一致[16，23]。

2.4 araE基因沉默菌株對不同種類苯丙素類化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)能力

基因沉默菌株 E.coli BL21 （DE3）/pRSF-asRNA-araE在1.0 g/L蘆丁環(huán)境中，通過不同濃度的IPTG（0、100、200和400 μmol/L）來控制其表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其最大比生長速率分別為0.24、0.22、0.19、0.14 h-1；在1.0 g/L柚皮素的環(huán)境中，其最大比生長速率分別為0.21、0.18、0.16、0.14 h-1；在1.0 g/L白藜蘆醇的環(huán)境中，其最大比生長速率分別為0.13、0.08、0.04、0.02 h-1，見圖6。

圖6 araE基因沉默菌株在不同濃度IPTG誘導(dǎo)后在不同種類苯丙素類化合物刺激下最大比生長速率Fig.6 μmaxof E.coli BL21 （DE3）/pRSF-asRNA-araE in the 1 g/L rutin，naringenin or resveratrol and induced by different concentrations of IPTG

對于基因沉默菌株E.coli BL21（DE3）/pRSF-asRNA-araE生長曲線的研究發(fā)現(xiàn)，AraE蛋白質(zhì)表達(dá)量的降低能夠降低大腸桿菌對于白藜蘆醇的耐受，而對于蘆丁和柚皮素沒有很明顯的效果。這個結(jié)果和基因過量表達(dá)的結(jié)果相符，從兩方面說明了AraE蛋白在大腸桿菌能夠轉(zhuǎn)運(yùn)白藜蘆醇，而對蘆丁和柚皮素沒有轉(zhuǎn)運(yùn)效果[24]。由于白藜蘆醇和AraE蛋白底物都具有多個羥基，并且都具有一定的極性，所以AraE對于白藜蘆醇也具有一定的轉(zhuǎn)運(yùn)效果[25]。

3 結(jié)語

隨著苯丙素類化合物對腫瘤、抗氧化等方面的研究深入，市場對其需求日益增加[26]。目前關(guān)于苯丙素類化合物合成研究也日益加快，在大腸桿菌以及釀酒酵母中都已成功構(gòu)建苯丙素類化合物的合成途徑[27]，所以解決高濃度苯丙素類化合物在胞內(nèi)的積累問題迫在眉睫，急需找到苯丙素類化合物的高效轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，降低胞內(nèi)的產(chǎn)物含量，降低代謝負(fù)擔(dān)，實(shí)現(xiàn)高效的苯丙素類化合物生產(chǎn)[28]。

作者考察了AarE通道蛋白對3種典型苯丙素類化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)情況，通過蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異，實(shí)現(xiàn)通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)能力的控制，結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌中的araE基因能夠提升大腸桿菌對白藜蘆醇的耐受能力，該研究對國內(nèi)開發(fā)使用大腸桿菌生產(chǎn)白藜蘆醇有一定的指導(dǎo)意義。但是關(guān)于轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理還需進(jìn)一步研究，而不僅僅局限識別羥基基團(tuán)，同時對蘆丁和柚皮素的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也還需進(jìn)一步研究。

作者所采用的基因沉默手段，解決了蛋白質(zhì)表達(dá)水平控制方面的難題。目前國內(nèi)的研究多數(shù)通過基因敲除手段實(shí)現(xiàn)酶的表達(dá)量降低，所需的實(shí)驗操作繁瑣，費(fèi)時長，而且在一些菌種不易實(shí)現(xiàn)。采用在轉(zhuǎn)錄水平上的mRNA調(diào)控，可以方便快速的抑制目的基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)代謝流的調(diào)控，對今后的相關(guān)研究有借鑒作用。

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Identification of araE Gene Associated with Response to Different Phenylpropanoids by Gene Silencing in Escherichia coli BL21

WANG Kui1，2， ZHOU Jingwen1，2， LI Jianghua*1，2
（1.Key Laboratory ofIndustrialBiotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.Schoolof Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

AraE is an important unidirectional transport channel protein that could transport some compounds outside the cell.E.coli is a common host-bacterial to produce phenylpropanoids，and the growth was inihibited by phenylpropanoids.In order to investigate the transport ability of AraE on phenylpropanoids in E.coli，the gene overexpression and silencing routes was used in this study to regulate the expression of AraE.The level of overexpression and silencing was confirmed by qPCR and SDS-PAGE.The transport ability of phenylpropanoids was measured by detection of the recombinant bacterial growth kinetics parameter （μmax）in different typical phenylpropanoids（rutin，naringenin and resveratrol）.The result showed that AraE could only transport resveratrol in E.coli.

araE，E.coli，phenylpropanoids，gene silencing，qPCR，transport

Q 786

A

1673—1689（2015）08—0856—08

2014-03-05

國家自然科學(xué)基金面上項目（31370130）。

*通信作者：李江華（1966—），男，江西九江人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事酶技術(shù)、發(fā)酵過程優(yōu)化與控制方面的研究。E-mail：lijianghua@jiangnan.edu.cn