隋麗英，王 嬌，高美榮，曾 衍

(天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457)

生物絮團(tuán)技術(shù)(biofloc technology，BFT)是在高密度和限制性水交換養(yǎng)殖系統(tǒng)中，通過投放碳源或直接投喂高碳低氮餌料來提高水體中的碳氮比(C/N)，促進(jìn)異養(yǎng)微生物將氨氮轉(zhuǎn)化成微生物蛋白，供養(yǎng)殖動(dòng)物再攝食，以達(dá)到凈化水質(zhì)和降低餌料成本的目的[1].已經(jīng)報(bào)道的適用于BFT 的養(yǎng)殖品種包括凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[2-5]，羅非魚(Oreo-chromis niloticus)[6-7]，日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicas)[8]和羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenburgii)[9]等.

鹵蟲(Artemia)主要分布于內(nèi)陸鹽湖和日曬鹽場蒸發(fā)池等高鹽度水體中，其生活史包括幼體、成蟲和休眠卵3 個(gè)階段.鹵蟲休眠卵易于保存和運(yùn)輸，經(jīng)過加工處理去休眠后，可孵化為幼體，是海水魚和甲殼類育苗的極佳生物餌料[10].鹵蟲卵的產(chǎn)量和質(zhì)量受種、品系和自然條件的影響較大[11].隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，鹵蟲卵需求量逐年增加，卵徑小、營養(yǎng)質(zhì)量高和易于休眠的高品質(zhì)鹵蟲的人工增養(yǎng)殖日益受到關(guān)注.

鹵蟲為非選擇性濾食動(dòng)物，主要以單胞藻和有機(jī)碎屑為食，攝食量大.高鹽條件下藻類生長受到限制，同時(shí)蒸發(fā)濃縮作用使鹵水中氮磷含量較高[12].將生物絮團(tuán)技術(shù)應(yīng)用于鹵蟲人工增養(yǎng)殖，通過調(diào)節(jié)C/N，促進(jìn)異養(yǎng)細(xì)菌的繁殖，為鹵蟲提供充足的餌料蛋白[13-14].本文研究較高鹽度下，碳源和C/N 對鹵蟲產(chǎn)量、水質(zhì)和鹵蟲營養(yǎng)組成的影響及其對生物餌料單胞藻的替代作用，為生物絮團(tuán)技術(shù)在鹵蟲人工增養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)一研究不同單胞藻投喂水平下碳源對鹵蟲成蟲產(chǎn)量和水質(zhì)的影響.實(shí)驗(yàn)共設(shè)3 大組，實(shí)驗(yàn)組分別添加蔗糖和淀粉(C/N 20)，對照組不添加任何碳源.每組設(shè)3 個(gè)單胞藻投喂水平，即正常投喂水平(NF)、較低投喂水平(LF，60%,,NF)和極低投喂水平(VLF，30%,NF).

實(shí)驗(yàn)二研究C/N 對鹵蟲成蟲產(chǎn)量、營養(yǎng)組成和水質(zhì)的影響.實(shí)驗(yàn)設(shè)5 組，分別添加蔗糖和淀粉，C/N分別為20 和40，對照組不添加任何碳源.單胞藻投喂水平為正常投喂量的60%,.

鹵蟲養(yǎng)殖條件為：溫度24～25,℃，鹽度50，連續(xù)充氣.實(shí)驗(yàn)周期為14,d.每組3 個(gè)平行樣，單位養(yǎng)殖水體為1,000,mL，鹵蟲初始密度為1.5,mL-1.

正常單胞藻投喂水平參考Vanhaecke 等[15]提出的杜氏鹽藻(Dunaliella salina)最佳投喂量，并根據(jù)養(yǎng)殖密度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整.碳源添加量參考Avnimelech[16]提出的式(1)計(jì)算.

式中：ΔCH 為碳源添加量；Feed 為投喂量；Nfeed為飼料氮含量；Nexcretion為養(yǎng)殖動(dòng)物排泄氮占投喂飼料氮的比例(一般為50%,)；0.05 為常數(shù).

杜氏鹽藻最適投喂水平及碳源添加量(C/N 20)的計(jì)算結(jié)果見表1.

表1 杜氏鹽藻最適投喂水平及碳源添加量(C/N 20)Tab.1 Optimal feeding level of Dunaliella salina and the supplementing amount of carbon source(C/N 20)

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

日曬鹽場鹵水(鹽度200)經(jīng)過消毒、曝氣和過濾處理后備用.養(yǎng)殖鹵蟲為兩性生殖品系A(chǔ)rtemia fransiscana Vinhchau strain.鹵蟲卵經(jīng)過18,h 孵化(溫度27～28,℃，鹽度30，光照度1,000,lx，連續(xù)充氣)，將初孵無節(jié)幼體轉(zhuǎn)至1,L 錐形管中暫養(yǎng)5,d(溫度24～25,℃，鹽度50，連續(xù)充氣)，鹵蟲密度為5,mL-1，每天早晚適量投喂?jié)饪s杜氏鹽藻.杜氏鹽藻用5,L 三角瓶培養(yǎng)(24～25,℃，鹽度50，光照度10,000,lx，連續(xù)充氣)，7,d 后將藻液濃縮離心(6,℃、6,000,r/min 離心10,min)，4,℃貯藏備用.

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 鹵蟲生物量

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用篩絹收集鹵蟲，用蒸餾水除去蟲體表面鹽分，用濾紙吸干蟲體表面水分，稱質(zhì)量，獲得鹵蟲生物量.

1.3.2 鹵蟲粗蛋白及脂肪酸含量

將每組各平行樣中收集的鹵蟲合并.采用凱氏定氮法測定粗蛋白，脂肪酸的測定參照Lepage 等[17]提出的方法，甲酯化脂肪酸(FAME)組成和含量用氣相色譜測定(Shimatzu)[11].

1.3.3 養(yǎng)殖水體細(xì)菌總數(shù)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取1 個(gè)平行樣，采用平板培養(yǎng)法估算水體中細(xì)菌總數(shù).營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10.0,g/L，牛肉浸粉3.0,g/L，瓊脂15.0,g/L，用鹽度為50 的鹵水配制.37,℃培養(yǎng)48,h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)目.

1.3.4 養(yǎng)殖水體理化指標(biāo)

水體pH 采用pH 計(jì)(Mettler)測定，黏度用烏氏黏度計(jì)測定，溶解氧采用YSI 溶氧儀測定.取平行樣中鹵水各50,mL 合并(體積共150,mL)，用0.25 μm微孔濾膜抽濾.根據(jù)GB/T 12763.4—2007《海洋調(diào)查規(guī)范·第4 部分：海水化學(xué)要素調(diào)查》[18]方法，分別采用重氮-偶氮法、鋅鎘還原法、次溴酸鈉氧化法和過硫酸鉀氧化法測定濾液中總銨鹽(TAN)、亞硝酸鹽()、硝酸鹽()和總氮(TN)濃度.

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics(version 19)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.所有組間數(shù)據(jù)用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行比較，采用Tukey’s multiple range test檢驗(yàn)顯著性差異(P＜0.05).圖中不同字母上標(biāo)表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異(P＜0.05).

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同單胞藻投喂水平下碳源對鹵蟲生長和水質(zhì)的影響

添加蔗糖和淀粉組別的鹵蟲生物量(以濕質(zhì)量計(jì))均顯著高于對照組(P＜0.05)(圖1)，而且添加碳源的LF 和VLF 組分別與未添加碳源的較高單胞藻投喂量對照組(NF 和 LF)鹵蟲生物量接近(P＞0.05).蔗糖和淀粉組沒有顯著差異(P＞0.05).

圖1 不同單胞藻投喂水平和添加碳源條件下鹵蟲生物量Fig.1 Total Artemia biomass at different feeding levels and supplemented with different carbon sources

表2 不同單胞藻投喂水平和添加碳源條件下養(yǎng)殖水體TAN、、和TN濃度Tab.2 Content of TAN，， and TN in Artemia culture area at different feeding levels and supplemented with different carbon sources

表2 不同單胞藻投喂水平和添加碳源條件下養(yǎng)殖水體TAN、、和TN濃度Tab.2 Content of TAN，， and TN in Artemia culture area at different feeding levels and supplemented with different carbon sources

注：—表示不加任何碳源，N/A 表示濃度低于檢測限.

實(shí)驗(yàn)過程中水體溶解氧水平在6.5～7.5,mg/L 范圍.不同單胞藻投喂水平下，未添加碳源的對照組水體pH 最高(P＜0.05)(圖2).添加碳源對鹵水黏度的影響不顯著(P＞0.05).

圖2 不同單胞藻投喂水平和添加碳源條件下養(yǎng)殖水體pH與黏度Fig.2 pH and viscosity of Artemia culture column at different feeding levels and supplemented with different carbon sources

2.2 不同碳源和C/N 對鹵蟲生長、營養(yǎng)組成和水質(zhì)的影響

添加蔗糖和淀粉顯著提高鹵蟲生物量(以濕質(zhì)量計(jì))(P＜0.05)，與2.1 中的結(jié)果一致(圖3).C/N 對鹵蟲生物量的影響不顯著(P＞0.05).

圖3 添加不同碳源和不同C/N條件下的鹵蟲生物量Fig.3 Total biomass of Artemia supplemented with different carbon sources and at different C/N ratios

蔗糖組養(yǎng)殖水體中細(xì)菌總數(shù)均高于淀粉組和對照組(表3).蔗糖組鹵蟲粗蛋白含量(以干質(zhì)量計(jì))最高，淀粉組最低.添加碳源使脂肪酸(以干質(zhì)量計(jì))C20∶5n3 含量明顯降低，C16∶1n7 含量明顯升高.與C/N 20 相比，C/N 40 條件下蔗糖組鹵蟲粗蛋白和脂肪酸含量有所上升，而淀粉組則有所降低.

在C/N 20 和C/N 40 條件下，添加蔗糖使水體pH 顯著低于對照組(P＜0.05)，淀粉組介于二者之間(圖4).添加碳源對鹵水黏度無顯著影響(P＞0.05).

表3 添加不同碳源和不同C/N條件下細(xì)菌總數(shù)、粗蛋白和鹵蟲脂肪酸含量Tab.3 Total bacterial count，crude protein content and fatty acid profile of Artemia supplemented with different carbon sources and at different C/N ratios

表4 不同碳源和不同C/N條件下鹵蟲養(yǎng)殖水體TAN、、和TN 濃度Tab.4 Content of TAN，，and TNinArtemiaculture columnsupplementedwith different carbon sources and atdifferent C/N ratios

表4 不同碳源和不同C/N條件下鹵蟲養(yǎng)殖水體TAN、、和TN 濃度Tab.4 Content of TAN，，and TNinArtemiaculture columnsupplementedwith different carbon sources and atdifferent C/N ratios

注：—表示不加任何碳源，N/A 表示濃度低于檢測限.

圖4 不同碳源和不同C/N 條件下鹵蟲養(yǎng)殖水體pH 和黏度Fig.4 pH and viscosity of Artemia culture column supplemented with different carbon sources and at different C/N ratios

3 討論

集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖中，養(yǎng)殖動(dòng)物的高密度和大量投放餌料使水體中氨氮大量積累.在各種氮形式中，NH3和對養(yǎng)殖動(dòng)物的毒害作用最強(qiáng)，特別是不帶電和脂溶性的非離子態(tài)NH3，比更容易通過生物膜，對動(dòng)物的毒害作用更大[19].微生物對水體中氨氮的移除主要通過3 種途徑：浮游植物的光合自養(yǎng)作用、自養(yǎng)細(xì)菌的亞硝化和硝化作用、異養(yǎng)細(xì)菌的同化作用[20].異養(yǎng)細(xì)菌對氨氮的固定能力是自養(yǎng)微生物的10 倍[21]，適當(dāng)添加碳水化合物可促進(jìn)異養(yǎng)細(xì)菌的生長，當(dāng)C/N＞10 時(shí)異養(yǎng)細(xì)菌對氮同化作用更強(qiáng)[22].通過適當(dāng)降低餌料中氮含量或向系統(tǒng)中添加碳源，促進(jìn)以異養(yǎng)細(xì)菌為主的生物絮團(tuán)的形成，對動(dòng)物生長和水質(zhì)調(diào)節(jié)有明顯促進(jìn)作用.

大多數(shù)微生物在高鹽條件下不能存活或生長較慢，但鹵水中存在的嗜鹽微生物(如嗜鹽細(xì)菌或嗜鹽古菌等)具有適應(yīng)高鹽環(huán)境的特殊細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝機(jī)制[23]，鹽度不是其生長和存活的限制因子.本研究向鹵蟲養(yǎng)殖系統(tǒng)中添加碳源，顯著降低單胞藻投喂量和水體中氮含量，提高鹵蟲產(chǎn)量，推測與碳源促進(jìn)水體中嗜鹽微生物對氮源(尤其是氨氮)的固定、形成微生物菌體蛋白替代部分生物餌料和水質(zhì)改善有關(guān).該結(jié)果與Toi 等[24]的研究一致，他們利用15,N 同位素標(biāo)記證實(shí)，添加碳源可促進(jìn)鹵蟲生長，而且在單胞藻投喂水平較低時(shí)，細(xì)菌被用作鹵蟲食物的比例較高.

鹵蟲的營養(yǎng)組成，尤其是脂肪酸組成與餌料密切相關(guān)[25].細(xì)菌中富含C16∶1n7 和C18∶1n7 脂肪酸，但是缺乏多不飽和及高不飽和脂肪酸[26]，而杜氏鹽藻則相反[27].本研究中添加碳源使鹵蟲脂肪酸C16∶1n7 顯著升高，而C20∶5n3 含量有所降低，說明鹵蟲攝食了菌體，并將其轉(zhuǎn)化為自身的脂肪酸.Avnimelech 等[28]利用15N 同位素標(biāo)記NH4Cl 和淀粉，研究高密度羅非魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中氨的同化作用，發(fā)現(xiàn)25%,的絮團(tuán)蛋白質(zhì)可被魚類利用.本研究中添加蔗糖使鹵蟲粗蛋白含量有所提高，與鹵蟲對生物絮團(tuán)菌體蛋白的攝食有關(guān).淀粉組鹵蟲的粗蛋白含量較僅投喂單胞藻的對照組低，與部分淀粉顆粒被鹵蟲濾食存在于消化道中，使相對于鹵蟲總干質(zhì)量計(jì)算的粗蛋白含量相對較低有關(guān).

有機(jī)碳源的種類決定生物絮團(tuán)形成、大小和營養(yǎng)組成(取決于微生物組成和細(xì)胞代謝產(chǎn)物)[1,29].比較蔗糖和淀粉兩種碳源，雖然鹵蟲生物量無顯著差別，但蔗糖組養(yǎng)殖水體中各種氮源濃度較低，且細(xì)菌總數(shù)較高，說明分子結(jié)構(gòu)簡單的蔗糖更容易被異養(yǎng)細(xì)菌利用，有利于生物絮團(tuán)的形成.本研究中提高C/N 對鹵蟲生物量的影響不顯著，但使水體中氮濃度有所降低，說明提高C/N 有利于異養(yǎng)細(xì)菌的同化作用.

鹵蟲屬小型浮游濾食性甲殼動(dòng)物，幼體攝食粒徑為6.8～27.5,μm[30]，成蟲攝食粒徑不大于50,μm[31].鹵蟲游泳能力較差，水體中較小的生物絮團(tuán)可被鹵蟲攝食利用，促進(jìn)鹵蟲的生長；而較大的絮團(tuán)不僅不能被攝食，反而可能黏附于鹵蟲復(fù)肢，不利于鹵蟲生長.本研究中碳源的添加顯著降低養(yǎng)殖水體pH，可能與異養(yǎng)細(xì)菌大量繁殖產(chǎn)生酸性代謝物有關(guān).自然條件下鹵蟲生長在鹽湖和鹽田蒸發(fā)池中，鹵水pH 為8 左右.而在偏酸性(pH＜6)水體中鹵蟲的生長、存活和生殖均受到影響[32]，因此將BFT 應(yīng)用于鹵蟲養(yǎng)殖系統(tǒng)中，有必要對絮團(tuán)大小和鹵水pH 進(jìn)行調(diào)控.

碳源種類的選擇與 BFT 的應(yīng)用成本密切相關(guān).本研究中選用了實(shí)驗(yàn)室常備的蔗糖和可溶性淀粉為碳源，但從經(jīng)濟(jì)效益考慮，選擇低成本的碳源(如糖蜜、麥麩和木薯粉等高碳農(nóng)副產(chǎn)品)是BFT 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中推廣應(yīng)用的必由之路.

綜上所述：在高鹽鹵蟲養(yǎng)殖系統(tǒng)中，在相同單胞藻投喂水平下，添加碳源(蔗糖和淀粉)顯著提高鹵蟲生物量，使養(yǎng)殖水體氮含量大幅降低，pH 有所下降.添加碳源使鹵蟲粗蛋白和脂肪酸C16∶1n7 含量有所升高，C20∶5n3 含量有所降低.提高C/N 對鹵蟲生物量的影響不顯著.總體而言，蔗糖的效果好于淀粉.

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