白皮杉醇苷在大鼠體內外的葡萄糖醛酸結合代謝研究

張靖悅，劉 卉，郝盛源，李方悅，許 卉

煙臺大學藥學院，煙臺 264005

白皮杉醇(反式-3，5，3＇，4＇-四羥基茋，PE)是天然抗氧化劑白藜蘆醇的3＇-羥基衍生物，在自然界中以苷的形式廣泛存在于多種植物中［1，2］。研究發(fā)現(xiàn)，在野生資源豐富的大黃類藏藥藏邊大黃(Rheum emodi Wall.)中，白皮杉醇的4＇-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(白皮杉醇苷，PG)含量高達7.5%以上，是其中含量最高的茋類成分［3，4］，并具有顯著的抗氧化活性［5，6］，為藏邊大黃多種以抗氧化為基礎藥效作用的重要功效成分之一。近年來，針對PG 作為天然抗氧劑候選藥物的深入研發(fā)備受關注。

ADME 特性是影響新藥發(fā)現(xiàn)和開發(fā)成敗的關鍵因素。我們在前期實驗研究［7］中發(fā)現(xiàn)，PG 在大鼠體內的口服生物利用度不足1%;經靜脈注射途徑給予大鼠PG，在給藥15 min 內即可在膽汁中發(fā)現(xiàn)多種代謝產物，并在相當長的時間內維持較高水平，但PG 原型藥物經膽汁和尿排泄的量都很低(＜5%)?；贚C-MS 的定性分析研究進一步發(fā)現(xiàn)，其中多種代謝產物為PG 或其衍生物的葡萄糖醛酸結合物。這一研究結果提示，與白藜蘆醇等天然茋類化合物相似［8，9］，PG 在體內可能經肝臟被快速地廣泛代謝，葡萄糖醛酸結合代謝則可能是其體內消除的重要途徑之一。本文在課題組前期研究基礎上，首次針對PG 在大鼠體內外的葡萄糖醛酸結合代謝特征進行系統(tǒng)的探索分析，以期為深入了解這一活性天然產物的體內代謝過程和后續(xù)研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

PG 由本實驗室從藏邊大黃藥材中經分離、純化制得，HPLC 純度＞98%，其化學結構經NMR 測試數(shù)據(jù)與文獻［10］對照確證;對硝基苯酚(4-NP，批號:20090710，天津市科密歐化學試劑有限公司);對硝基 苯 酚-β-葡 萄 糖 醛 酸 苷 (4-NPG，批 號:035K3796V)、尿苷-二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA，批號:SLBC9398V)購自Sigma 公司;其他試劑和溶劑均為市售分析純或色譜純。

1.2 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀(美國Agilent 公司)，包括在線脫氣機、二元高壓泵、自動進樣器和VWD 檢測器;Thermo TSQ Quantum Access 三重四級桿串聯(lián)質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific Inc.)，包括電噴霧離子源，串連四級桿質譜檢測器和Xcalibur 色譜工作站。

1.3 動物

健康SD 大鼠，雄性，體重(220 ± 20)g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK(京)2012-0001。

1.4 方法

1.4.1 大鼠膽汁樣品采集與處理

大鼠經腹腔注射10%水合氯醛麻醉后做膽管插管手術，結扎固定，收集一定體積空白膽汁后，經尾靜脈注射給予PG(20 mg/kg)，按一定時間間隔收集含藥膽汁樣品。取膽汁樣品100 μL，加10 μL 5%甲酸水，渦旋混勻后加3 mL 乙酸乙酯-正丁醇(5∶1，v/v)混合溶劑，繼續(xù)渦旋5 min，離心(8000 rpm)10 min，取上清，40 ℃水浴下氮氣吹干，殘渣以100 μL 流動相復溶，離心(12000 rpm)10 min，取上清，進行HPLC-UV 及LC-MS 分析。

1.4.2 大鼠肝微粒體制備與表征

大鼠于實驗前禁食12 h，自由飲水。斷頭處死后，迅速取出肝臟，稱重，剪碎，置冰水浴中，加入適量蔗糖溶液(0.25 mol/L)，混勻，4 ℃下離心(11500 rpm)20 min 得肝S9 組分，經進一步的鈣沉淀法制備肝細胞液和肝微粒體［11］，于-80 ℃下分裝保存，備用?？捡R斯亮藍染色法測定所制肝微粒體的蛋白濃度為(12.8 ± 0.16)mg/mL(n=6);肝微粒體UGTs 酶活力以HPLC-UV 法測定4-NP 葡萄糖醛酸結合代謝物4-NPG 生成速率表征［12］，結果為(9.68± 0.09)nmol/(min(mg)(n=6)。

1.4.3 肝微粒體體外溫孵代謝［13，14］

孵育體系含2 mmol/L MgCl2、適量UDPGA 輔因子和大鼠肝微粒體(含微粒體蛋白1.2 mg/mL)，以磷酸鹽緩沖液(pH 7.4，0.1 mol/L)調節(jié)總體積至400 μL，置37 ℃恒溫水浴中振蕩預孵育2 min，加入PG 溶液10 μL，繼續(xù)孵育一定時間后，加10%甲酸水溶液100 μL 終止反應，按1.4.1 項下方法進行萃取處理，待測。

1.4.4 色譜與質譜條件

色譜條件:Diamonsil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相:乙腈-水(含0.1%甲酸)20∶80(v/v)，流速1.0 mL/min、柱溫30 ℃、檢測波長320 nm、進樣量20 μL;質譜條件:進樣方式:分流進樣(分流比為3∶1)，電噴霧(ESI)離子源，負離子(Negative)方式檢測，掃描范圍質核比(m/z)100-1000，氣動輔助電噴霧離子化，噴霧電壓3.5 kV，毛細傳輸管溫度350 ℃，鞘氣壓力30 psi，輔助氣壓力5 bar，碰撞氣(氦氣)、鞘氣(氮氣)流速0.75 L/min，輔助氣(氮氣)流速0.15 L/min。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

以底物消除法測定酶促代謝反應速率，分別繪制Michaelis -Menten 曲線和Lineweaver -Buck 雙倒數(shù)曲線，據(jù)此進一步計算得PG 在大鼠肝微粒體中葡萄糖醛酸結合代謝的動力學參數(shù)，包括最大反應速度Vmax(方程截距的倒數(shù))、米氏常數(shù)Km(方程斜率與截距的比值)和肝內消除率CLint(Vmax/Km)。

2 實驗結果

2.1 PG 在大鼠體內外葡萄糖醛酸結合代謝及其一致性分析

2.1.1 大鼠膽汁中PG 葡萄糖醛酸結合代謝產物分析

在PG 的最大UV 吸收波長(320 nm)下分別對大鼠空白膽汁、加標的空白膽汁以及給藥后的膽汁樣品進行HPLC-UV 測定，結果如圖1(A、B、C)所示。在分析條件下，大鼠膽汁中內源性物質幾乎不出峰(圖1-A)，不干擾對PG 的檢測(圖1-B)，但在i.v.給藥15 min 后的大鼠膽汁樣品色譜圖(圖1-C)中明顯可見PG 和多個峰面積顯著高于PG 的非內源性物質色譜峰。進一步的LC-MS 分析結果(圖2)顯示，色譜保留時間分別為4.53 min 和5.48 min的M1、M2 m/z(［M-H］-)均為581 Da，較原形藥物PG 的m/z(［M-H］-)405 Da 增加了176 Da，推測為PG 分子結構中不同位置上羥基的單葡萄糖醛酸結合物;M3 為8.65 min 處的色譜峰，其m/z(［M-H］-)為433 Da，較PG 苷元PE 的m/z(［M-H］-)243 Da增加了190 Da (14 +176 Da)，推測M3 可能為PG在體內水解為苷元PE 后，其分子結構中兩個羥基分別結合一個甲基和一個葡萄糖醛酸的代謝產物。

2.1.2 PG 在大鼠肝微粒體中的葡萄糖醛酸結合代謝

對比不同肝微粒體體外溫孵體系的HPLC-UV分析結果(圖1-D、E、F)，發(fā)現(xiàn)PG 與不含UDPGA 輔因子的大鼠肝微粒體共孵育時基本沒有發(fā)生改變，在孵育體系中未出現(xiàn)除PG 外的非內源性物質色譜峰，表明PG 在大鼠肝微粒體孵育體系中具有良好的非代謝穩(wěn)定性。在PG 與大鼠肝微粒體共孵育8 min 的體系中，在PG 色譜峰前增加了兩個明顯的非內源性物質色譜峰(圖1F)，且其色譜峰面積在一定時間內隨溫孵時間延長逐漸增大，而PG 的色譜峰面積相應減小。上述研究結果表明，PG 在大鼠肝微粒體體外溫孵體系中發(fā)生了經UGTs 介導的代謝轉化。進一步針對相同分析條件下的體內外代謝樣品HPLC-UV 譜圖(圖1-C、1-F)進行對比分析，發(fā)現(xiàn)PG在大鼠肝微粒體孵育體系中生成的兩個主要代謝產物峰與給藥膽汁樣品中的單葡萄糖醛酸結合代謝物M1、M2 色譜保留時間基本一致(tR分別為4.53 min、5.48 min)，且M1 的豐度均高于M2，表明PG在大鼠體內外的葡萄糖醛酸結合代謝具有良好的一致性。

2.2 HPLC-UV 測定大鼠肝微粒體孵育體系中PG含量方法的建立與考察

2.2.1 專屬性與線性

如圖1 所示，在所建立的HPLC 分析條件下，大鼠肝微粒體中PG 的色譜峰型良好，且與其代謝產物及內源性物質均有足夠的分離度，表明大鼠肝微粒體中內源性物質不干擾PG 的測定，所建立HPLC-UV 方法專屬性良好。PG 的色譜峰面積(Y)與肝微粒體中PG 濃度(X，mmol/L)間線性回歸的典型方程為:Y=90.05X +0.014(r=0.9992)，在0.05～0.70 mmol/L 范圍內線性關系良好。

圖1 PG 及其在大鼠體內外代謝產物的HPLC-UV 色譜圖Fig.1 HPLC-UV chromatograms of PG and its metabolites in rat in vivo and in vitro

圖2 給藥15 min 后大鼠膽汁樣品的HPLC-UV 色譜圖(A)、TIC 圖(B)及葡萄糖醛酸結合代謝物M1(C)、M2(D)、M3(E)的一級質譜圖Fig.2 HPLC-UV (A)and total ion (B)chromatograms of bile sample of rat after administration 15 min and HPLC-MS spectrum of glucuronide metabolites M1 (C)，M2 (D)and M3 (E)

2.2.2 精密度

以滅活大鼠肝微粒體為基質，分別配制含PG 0.1、0.3、0.6 mmol/L 的低、中、高濃度QC 樣品，按1.4.3 項下處理后進行HPLC-UV 分析。分別按照測定方法在1 d 內每個濃度平行測定6 個樣品，并在6 d 內重復測定6 次。根據(jù)測定結果，計算得低、中、高三個濃度下肝微粒體中PG 含量測定的日內精密度(RSD，n=6)分別為3.01%、2.86% 和3.43%;日間精密度(RSD，n=6)分別為4.16%、3.37%、3.52%。精密度符合生物樣品測定要求。

2.2.3 回收率與準確度

以滅活大鼠肝微粒體為基質，分別配制含PG 0.1、0.3、0.6 mmol/L 的低、中、高濃度QC 樣品，按1.4.3 項下處理。同時以空白緩沖液代替肝微粒體基質制備各濃度QC 樣品的對照溶液。根據(jù)對各樣品的HPLC-UV 測定結果，計算得低、中、高濃度下PG 測定的回收率(n=6)均在80%以上，分別為(80.5 ±3.0)%、(89.3 ±2.1)%、(91.6 ±1.4)%;準確度(相對回收率，n=6)分別為(101.5 ±3.4)%、(100.2 ±2.5)%、(98.9 ±2.7)%，均在85%～115%范圍內。研究結果表明，本文所建立的HPLC-UV 方法符合生物樣品測定的準確度要求，適用于肝微粒體中PG 含量的測定。

2.3 大鼠肝微粒體中PG 葡萄糖醛酸結合代謝的酶促反應動力學

2.3.1 時間的影響

設置溫孵體系中PG 的初始濃度為0.16 mmol/L，肝微粒體蛋白濃度為1.2 mg/mL，在37 ℃水浴中振蕩溫孵，分別于1、3、5、8、10、15、20 min 取樣，按1.4.3 項下方法處理后測定PG 濃度。如圖3-A 所示，在溫孵1～8 min 內PG 基本呈線性消除(r=0.9986)，此后代謝消除迅速減緩，至20 min 達到最大反應速度。

2.3.2 UDPGA 供體濃度的影響

設置溫孵體系中PG 的初始濃度為0.16 mmol/L，肝微粒體蛋白濃度為1.2 mg/mL，UDPGA 的濃度分別為0.6、1.25、1.5、2、2.5、3 mmol/L，溫孵8 min后取樣，按1.4.3 項下方法處理后測定PG 濃度。如圖3-B 所示，在UDPGA 供體濃度在0.25～2.5 mmol/L 范圍時PG 基本呈線性消除(r=0.9912)，此后代謝消除逐漸減緩，至3 mmol/L 達到最大反應速度。

2.3.3 底物濃度對代謝速率的影響

設置溫孵體系中肝微粒體蛋白濃度為1.2 mg/mL，UDPGA 供體濃度為2.5 mmol/L，在0.1～0.6 mmol/L 范圍內改變底物PG 的初始濃度，溫孵時間8 min 后取樣，按1.4.3 項下方法處理后測定PG 濃度。如圖4-A 所示，在0.1～0.6 mmol/L 底物濃度范圍內，PG 的代謝反應速率隨底物濃度增加而增加，此后，不再隨底物濃度增大繼續(xù)增加，表明孵育體系中代謝酶與底物的結合已趨飽和狀態(tài)。

根據(jù)孵育體系中的肝微粒體蛋白濃度以及反應時間，計算酶促反應速率，分別繪制Michaelis -Menten 曲線和Lineweaver -Buck 雙倒數(shù)曲線如圖4-A、B 所示。進一步計算得PG 在大鼠肝微粒體中葡萄糖醛酸結合代謝反應的最大反應速率Vmax、米氏常數(shù)Km和肝內清除率CLint(Vmax/Km)分別為10.11 nmol/(min·mg)、0.36 mmol/L、0.028 mL/(min·mg)。

圖3 在大鼠肝微粒體孵育體系中，孵育時間(A)和UDPGA 濃度(B)對PG 代謝的影響Fig.3 Effect of incubation time (A)and concentration of UDPGA (B)on metabolism of PG in the incubation system of rat liver microsomes

圖4 大鼠肝微粒體孵育體系中PG 葡萄糖醛酸結合代謝的米氏動力學曲線(A)和雙倒數(shù)曲線(B)Fig.4 Michaelis-Menten kinetic curve (A)and Lineweaver-Buck double reciprocal curve (B)of glucuronidation of PG in the incubation system of rat liver microsomes

3 討論

PG 是藏邊大黃中含量最高的茋類成分，具有顯著的抗氧化活性，近年來作為天然抗氧劑候選藥物被廣泛關注。本文在前期研究基礎上，首次通過HPLC-UV 和LC-MS 分析研究了PG 在大鼠體內外的葡萄糖醛酸結合代謝。結果發(fā)現(xiàn)，經靜脈注射途徑進入大鼠體內的PG 會經肝臟快速代謝生成多種葡萄糖醛酸結合物，其中以羥基的單葡萄糖醛酸結合產物為主;在大鼠肝微粒體體外溫孵體系中，PG經UGTs 介導發(fā)生快速的葡萄糖醛酸結合代謝，主要生成兩個在結構和豐度上均與體內一致的單葡萄糖醛酸代謝物，表明PG 的葡萄糖醛酸結合代謝具有較好的體內外一致性。后續(xù)可通過體外重組酶實驗進一步進行代謝表型的深入研究。

本文研究建立了大鼠肝微粒體中PG 含量的HPLC-UV 方法，經專屬性、線性、精密度、回收率與準確度驗證項目考察，表明該方法具有靈敏、準確、快速的特點，適用于底物消除法研究PG 在大鼠肝微粒體溫孵代謝的反應動力學。在肝微粒體蛋白濃度為1.2 mg/mL、供體濃度為2.5 mmol/L 溫孵代謝反應8 min 的大鼠肝微粒體體外溫孵體系中，PG 的葡萄糖醛酸結合代謝呈現(xiàn)飽和動力學特征，其代謝消除符合米氏方程。酶促代謝反應的主要動力學參數(shù)Vmax、Km、CLint(Vmax/Km)分別為10.11 nmol/(min·mg)、0.36 mmol/L、0.028 mL/(min·mg)，與白藜蘆醇的Km值［15］基本一致，表明大鼠肝臟中UGTs酶對PG 具有較強的親和力，可催化其發(fā)生快速的葡萄糖醛酸結合代謝。

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