鹽生肉蓯蓉總苷對實驗性肝損傷的保護(hù)作用

王艷芳，趙繼軍，海鵬麗，薛培鳳，李 輝，李旻輝*

1包頭醫(yī)學(xué)院，包頭 014040;2 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，包頭 014010;3 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010110;4 內(nèi)蒙古大蕓生物有限公司，包頭 014010

鹽生肉蓯蓉(Citanche salsa)是列當(dāng)科(Orobanchaceae)肉蓯蓉屬(Cistanche)植物，又名鹽生大蕓，為多年生草本寄生植物，主要分布于荒漠、沙漠等干燥地帶，主要產(chǎn)區(qū)在我國新疆和內(nèi)蒙古［1］。由于其同科同屬藥材肉蓯蓉(Herba Cistanche)被大量采挖，加之寄生植物繁殖困難，藥用資源日趨減少，難以滿足市場需求。在我國民間鹽生肉蓯蓉被用于肉蓯蓉的代用品，但其研究報道較少。為進(jìn)一步明確其藥用價值，對鹽生肉蓯蓉總苷(total glycosides of Cistanche salsa)，一類含苯乙醇苷類結(jié)構(gòu)成分的物質(zhì)進(jìn)行了藥理研究。鹽生肉蓯蓉總苷對神經(jīng)具有保護(hù)作用［2］，并能保護(hù)羥基(OH·)引發(fā)的DNA 氧化損傷［3］。鹽生肉蓯蓉苯乙醇苷可以顯著提高小鼠心、肝、腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性［4］。以上研究提示鹽生肉蓯蓉總苷具有抗氧化的作用。

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的發(fā)病率在我國呈逐年上升的趨勢，酒精已成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損害的第二大病因［5］。對于酒精性肝損傷的治療，現(xiàn)缺少安全有效的藥物。如何利用植物資源開發(fā)解酒保肝的藥物及保健品受到醫(yī)藥及食品行業(yè)的廣泛關(guān)注，經(jīng)大量查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)酒精性肝損傷和氧化應(yīng)激有關(guān)系，而鹽生肉蓯蓉總苷對酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究尚屬空白，本實驗的研究為鹽生肉蓯蓉總苷開發(fā)、利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

鹽生肉蓯蓉由包頭醫(yī)學(xué)院蒙藥材鑒定與標(biāo)準(zhǔn)化重點實驗室提供;聯(lián)苯雙酯滴丸(浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司，批號A02121139);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、丙二醛(MDA)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20110422);56°白酒(北京紅星股份有限公司);其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 動物

昆明種雄性小鼠72 只，體重17～22 g(內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號:scxk(蒙2002-0001))。

1.3 儀器

紫外可見分光光度計［尤尼柯(上海)儀器有限公司，型號UV-2000］;酶標(biāo)儀(美國貝克曼庫爾特，型號AD340);高速離心機(jī)(杭州艾普儀器設(shè)備有限公司，型號TG18-WS);高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技，型號Ultimate 3000);分析天平(梅特勒—托利多儀器有限公司，型號AR153O);超聲振蕩儀(上海Branson，型號SB3200);冷凍干燥劑(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司，型號FD-1-50)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽生肉蓯蓉總苷活性研究

2.1.1 鹽生肉蓯蓉總苷提取

2.1.1.1 粗提物的提取

稱取鹽生肉蓯蓉粗粉100 g，加70%乙醇600 mL 浸泡3 h，超聲提取30 min，過濾，濾渣重復(fù)上述步驟2 次，合并濾液濃縮回收乙醇至無醇味，收集提取物冷凍干燥，得鹽生肉蓯蓉粗提浸膏19.46 g。

2.1.1.2 純化過程

將鹽生肉蓯蓉粗提浸膏10 g 置于燒杯中，加20 mL 水在超聲波中溶解，加80 mL 無水乙醇搖勻靜止放置12 h，過濾，濾液濃縮回收乙醇至無醇味，冷凍干燥，得鹽生肉蓯蓉總苷提取物8.408 g。

2.1.2 動物的分組與給藥

72 只小鼠，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，隨機(jī)分為6組，每組12 只，分別為空白對照組、酒精性肝損傷模型組、陽性對照組(150 mg/kg 聯(lián)苯雙酯)、鹽生肉蓯蓉總苷高劑量組(130 mg/kg)、鹽生肉蓯蓉總苷中劑量組(100 mg/kg)和鹽生肉蓯蓉總苷低劑量組(65 mg/kg)。各組動物每日灌胃(ig)給藥2 次，ig容積均為0.2 mL/20 g 體重。空白對照組和模型組給予等體積的生理鹽水。每次給藥后2 h，除空白對照組外，其余各組按0.4 mL/20 g 體重ig 給予56°白酒，連續(xù)10 d 造成急性酒精性肝損傷模型。于造模第9 d 禁食不禁水，第10 d 給予56°白酒3 h 后眼球取血并分離血清，取血后處死小鼠，迅速摘取肝臟，冰冷的生理鹽水漂洗，濾紙吸干后稱重，取肝臟右葉置于10%甲醛固定液中，其余肝臟置于-20 ℃的冰箱中。

2.1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，方差分析，P＜0.05 有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.1.4 鹽生肉蓯蓉總苷對小鼠急性酒精性肝損傷的體重、肝重和肝臟指數(shù)的影響

如表1 所示，模型組小鼠的肝重和肝臟指數(shù)與空白對照組相比顯著升高(P＜0.05)，表明肝臟受損。與模型組相比，鹽生肉蓯蓉總苷高劑量組與陽性對照組小鼠的肝重和肝臟指數(shù)顯著降低(P＜0.01)，鹽生肉蓯蓉總苷中、低劑量組無顯著差異(P＞0.05)。

表1 鹽生肉蓯蓉總苷對小鼠的體重、肝重影響(ˉ，n=9)Table 1 The effect of total glycosides of C.salsa on body weight and liver weight (ˉ，n=9)

表1 鹽生肉蓯蓉總苷對小鼠的體重、肝重影響(ˉ，n=9)Table 1 The effect of total glycosides of C.salsa on body weight and liver weight (ˉ，n=9)

注:與空白對照組比較，△P＜0.05;與模型組比較，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01Note:Compared with blank control，△P＜0.05;compared with model group，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01

2.1.5 鹽生肉蓯蓉總苷對血清AST 和ALT 的影響

如表2 所示，模型組小鼠血清中ALT、AST 與空白對照組相比顯著升高(P＜0.05)，說明模型組造模成功。陽性對照組小鼠血清ALT、AST 與模型組相比均顯著降低(P＜0.01)。鹽生肉蓯蓉總苷高劑量組小鼠血清ALT、AST 與模型組相比顯著降低(P＜0.01)。鹽生肉蓯蓉總苷中、低劑量組與模型組比較均無顯著性差異(P ＞0.05)。

表2 鹽生肉蓯蓉總苷對血清中ALT、AST 的影響(ˉ，n=9)Table 2 Effects of total glycosides of C.salsa on serum aminotransferase activities (ˉ，n=9)

表2 鹽生肉蓯蓉總苷對血清中ALT、AST 的影響(ˉ，n=9)Table 2 Effects of total glycosides of C.salsa on serum aminotransferase activities (ˉ，n=9)

注:與空白對照組比較，△P＜0.05;與模型組比較，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01。Note:Compared with blank control，△P＜0.05;compared with model group，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01.

2.1.6 鹽生肉蓯蓉總苷對肝臟中的MDA 含量和SOD 活性的影響

取0.3 g 肝臟組織制備10%和1%勻漿液，將1%肝臟勻漿與3.5 ×103r/min 離心10 min 取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法測定肝勻漿中的蛋白。取1%肝臟勻漿上清液，按SOD 測試盒操作，酶標(biāo)儀450 nm 處讀數(shù)。取10%肝臟勻漿上清液，按MDA測定試劑盒操作，分光光度計532 nm 測吸光度(A532)。

如表3 所示，模型組小鼠肝臟中的MDA 含量與空白對照組相比顯著升高(P＜0.05)，SOD 活性顯著降低(P＜0.05)。陽性對照組小鼠肝臟中的MDA 含量與模型組相比顯著降低(P＜0.01)，SOD的活性顯著增高(P＜0.01)。鹽生肉蓯蓉總苷高劑量組MDA 含量與模型組相比顯著降低(P＜0.01)，SOD 的活性顯著增高(P＜0.01)。鹽生肉蓯蓉總苷中、低劑量組MDA、SOD 與模型組相比均無差異(P＞0.05)。

表3 鹽生肉蓯蓉總苷對肝臟組織中MDA、SOD 含量的影響(ˉ，n=9)Table 3 Effects of total glycosides of C.salsa on hepatic MDA，SOD levels (ˉ，n=9)

表3 鹽生肉蓯蓉總苷對肝臟組織中MDA、SOD 含量的影響(ˉ，n=9)Table 3 Effects of total glycosides of C.salsa on hepatic MDA，SOD levels (ˉ，n=9)

注:與空白對照組比較，△P＜0.05;與模型組比較，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01。Note:Compared with blank control，△P＜0.05;compared with model group，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01.

2.1.7 鹽生肉蓯蓉總苷對小鼠肝組織病理變化的影響

病理學(xué)檢查:10%甲醛固定的肝組織，常規(guī)石蠟包埋切片(片厚5 μm)，HE 染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

空白對照組小鼠肝臟色澤暗紅色，質(zhì)地軟，鏡下見肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝索呈網(wǎng)狀排列，肝血竇明顯，細(xì)胞呈多邊形，分界清楚，細(xì)胞核圓而清晰位于細(xì)胞中央。模型組和鹽生肉蓯蓉總苷中、低劑量組小鼠肝臟體積增大，顏色發(fā)黃，鏡下病理變化以肝細(xì)胞脂肪變性為主，可見細(xì)胞內(nèi)彌漫性的脂質(zhì)空泡，肝細(xì)胞腫大，胞漿內(nèi)充滿了微小脂滴空泡，核仍在中央。陽性對照組和鹽生肉蓯蓉總苷高劑量組小鼠肝細(xì)胞脂變情況有一定程度的減輕，脂滴數(shù)量有一定程度的降低。

油墩子是將調(diào)稀的面糊，少許倒入橢圓形鐵勺中，加蔥花和咸的蘿卜絲，最后用箸挾上一條溪蝦，再復(fù)以面糊入油鍋炸，出鍋的油墩子擱在油鍋上端的鐵絲網(wǎng)里“嘀溜溜”地瀝著殘油，香味早已讓百米之內(nèi)的人折服。演變后的油墩子省去了蝦的原料，餡料就是清香的蘿卜絲。

圖1 空白對照組(A)、模型組(B)、陽性對照組(C)、肉蓯蓉總苷高劑量組(D)、肉蓯蓉總苷中劑量組(E)、肉蓯蓉總苷低劑量組(F)的小鼠肝臟病理變化(HE×400)Fig.1 Histological changes in mice liver of blank control group (A)，model group(B)，positive control group(C)，C.salsa total glycosides high dose group(D)，C.salsa total glycosides middle dose group (E)and C.salsa total glycosides low dose group (F)［All sections were stained with hematoxylin and eosin(×400)］

2.2 鹽生肉蓯蓉總苷主成分分析

2.2.1 色譜條件

色譜條件為色譜柱ZORBAX ODS(250×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇-0.2%甲酸溶液(27.5∶72.5)，梯度洗脫;柱溫30 ℃;流速1 mL/min;檢測波長334 nm。以上色譜條件時，松果菊苷與毛蕊花糖苷分離度良好，見圖2。

圖2 對照品(A)、樣品(B)的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of reference standards (A)and sample (B)

2.2.2 對照品溶液制備

精密稱取松果菊苷、毛蕊花糖苷對照品1.3 mg、1.2 mg，制成0.13 mg/mL 松果菊苷對照品溶液和0.12 mg/mL 毛蕊花糖苷對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備

精密稱取0.1082 g 鹽生肉蓯蓉總苷提取物，用流動相溶液定容至50 mL。

2.2.4 線性關(guān)系

精密吸取對照品溶液0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.48、0.54、0.72、1.20 mg/mL，依次進(jìn)樣5 μL入液相色譜儀，以2 種對照品的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，計算回歸方程。松果菊苷:Y=11.868X-0.0785，R=0.9997;毛蕊花糖苷:Y=18.026X-0.1913，R=0.9997，結(jié)果松果菊苷對照品在0.0635～0.4445 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;毛蕊花糖苷對照品在0.059～1.18 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液10 μL，在上述色譜條件下依法重復(fù)進(jìn)樣5 次，記錄色譜圖，測定其峰面積，結(jié)果松果菊苷的RSD 1.89%，毛蕊花糖苷的RSD 1.87%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、32、40、48 h，精密吸取10 L，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定其峰面積，結(jié)果松果菊苷的RSD 1.58%，毛蕊花糖苷的RSD 0.49%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批樣品約0.2 mg，共5 份，制備溶液5 份，按含量測定方法，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定其峰面積，結(jié)果松果菊苷的RSD 1.91%，毛蕊花糖苷的RSD 2.08%，表明測定方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.8 回收率試驗

精密稱取鹽生肉蓯蓉總苷0.2 g，分別加入一定量的松果菊苷與毛蕊花糖苷對照品，照上述2.2.3項下方法制得供試品溶液，在規(guī)定色譜條件下，按含量測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果松果菊苷的平均回收率為98.49%，RSD 1.06%，毛蕊花糖苷的平均回收率為97.35%，RSD 1.45%。

2.2.9 樣品的測定

精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣，照上述色譜條件測定，以外標(biāo)法計算樣品含量，結(jié)果見表4，松果菊苷平均含量為24.5%，毛蕊花糖苷平均含量為4.6%。

表4 鹽生肉蓯蓉總苷中松果菊苷與毛蕊花糖苷的含量測定結(jié)果(%)Table 4 Content determination results of echinacoside and acteoside in total glycosides of C.salsa (%)

3 討論

酒精性肝損傷，是指由于長期大量飲酒而導(dǎo)致的肝臟損害及一系列病變。長期過量酒精攝入，會導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，進(jìn)而發(fā)展為肝纖維化，甚至肝硬化［6］。本實驗鹽生肉蓯蓉總苷高劑量組與模型組相比，小鼠血清中ALT、AST 活性顯著降低，肝臟中MDA 含量顯著降低，SOD 的活性顯著增高，一定程度的減輕了肝細(xì)胞脂變情況，降低脂滴數(shù)量。中、低劑量組與模型組比較均無顯著差異。本實驗結(jié)果與肉蓯蓉總苷對小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究結(jié)果一致［7］。鹽生肉蓯蓉總苷保護(hù)肝細(xì)胞損傷，可通過降低應(yīng)細(xì)胞膜通透性增加，釋放入血液中的ALT、AST 含量;可升高SOD 的活性，清除因酒精在機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的大量自由基;可降低MDA 形成，阻止其損傷組織細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)［8-10］。鹽生肉蓯蓉總苷對酒精性肝損傷具有保護(hù)作用，且存在量-效應(yīng)關(guān)系。查閱文獻(xiàn)，未見有鹽生肉蓯蓉總苷活性成分的定量分析。本文通過HPLC 首次定量分析了鹽生肉蓯蓉總苷主要成分毛蕊花糖苷和松果菊苷含量，占總苷29.1%。為鹽生肉蓯蓉總苷的開發(fā)、利用提供科學(xué)依據(jù)。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，松果菊苷對過氧化氫損傷的PC12 細(xì)胞及血管性癡呆大鼠氧化應(yīng)激損傷均有保護(hù)作用［11，12］。松果菊苷和毛蕊花糖苷對DGalN 及TNF-α 誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的細(xì)胞毒均有抑制作用［13］。進(jìn)而推測鹽生肉蓯蓉總苷保護(hù)小鼠酒精性肝損傷可能是通過松果菊苷和毛蕊花糖苷增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化酶活性，提高了肝細(xì)胞的抗氧化能力，從而維持肝細(xì)胞質(zhì)膜的完整性，使肝細(xì)胞發(fā)揮正常的防御和代償功能。我們將在以后的研究中進(jìn)一步分離化合物，運用分子生物學(xué)技術(shù)，研究單體化合物調(diào)節(jié)肝細(xì)胞凋亡及其與相關(guān)靶基因調(diào)控的關(guān)系。

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