薛 健，于 軒，楊軍祥，謝文章，王 珂，＊（執(zhí)筆）

（1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?44000；2.甘肅省畜牧管理局；3.甘肅省環(huán)縣畜禽改良站）

利用隴東優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)絨山羊種公羊精液，通過人工授精技術(shù)改良當(dāng)?shù)亟q山羊是目前培育隴東絨山羊新類群的最有效的手段之一，推廣優(yōu)質(zhì)細(xì)管凍精可以顯著提高當(dāng)?shù)亟q山羊品種質(zhì)量，而凍精活力是影響受胎率關(guān)鍵因素。目前羊的細(xì)管凍精活力不高，是制約羊細(xì)管冷凍精液推廣應(yīng)用的關(guān)鍵因素。在國(guó)內(nèi)，1981年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所冷凍山羊凍精試驗(yàn)取得成功，趙曉娥等在制作波爾山羊的細(xì)管冷凍精液時(shí)，采用離心去除掉精漿，獲得了良好的冷凍效果。通過參考山羊精液冷凍保存關(guān)鍵技術(shù)和研究成果，本試驗(yàn)對(duì)隴東絨山羊精液采取離心去除精漿，稀釋后細(xì)管封裝，液氮熏蒸冷凍，以期提高隴東絨山羊細(xì)管凍精的活力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)羊的選擇

選擇2～3歲，體質(zhì)健康，性欲旺盛的隴東優(yōu)質(zhì)絨山羊種公羊3只，飼養(yǎng)在甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)羊場(chǎng)，受體母羊?yàn)榄h(huán)縣普通隴東絨山羊。

1.2 試劑藥品及儀器

葡萄糖、檸檬酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）均為國(guó)產(chǎn)分析純，青霉素，鏈霉素均哈爾濱制藥廠產(chǎn)品。卵黃為市場(chǎng)購(gòu)買的新鮮雞蛋中抽取，冷凍液氮槽為自制，移液槍（德國(guó)Eppendorf），顯微鏡（日本NIKON）。

1.3 精液制備

采用假陰道法采精，每只公羊每日采精液2次，間隔15min，將兩次所采同一試驗(yàn)種公羊的精液混合，平均每只羊采精量為1.5mL左右，密度在22.5億／mL，鮮精活力在0.75以上。通過觀感和鏡檢后進(jìn)行第一次基礎(chǔ)液稀釋。

1.4 稀釋液配方

基礎(chǔ)液：蒸餾水100 mL，Tirs 3.32g，檸檬酸1.82g，葡萄糖1.0g，青霉素1 000萬IU，鏈霉素1 000μg；稀釋I液：取基礎(chǔ)液80mL加入20mL卵黃；稀釋II液：取I液46mL，加入甘油4mL。冷凍稀釋液的甘油最終濃度為4%。

1.5 稀釋冷凍

將采集的精液進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行離心處理。預(yù)先將稀釋I液在36 ℃水域中平衡10min，按體積比1∶4稀釋處理的精液，用16層紗布包裹，在4 ℃冰箱緩慢降溫平衡60min后，使之與等溫平衡的稀釋II液等倍稀釋混合，然后再平衡60min，在4 ℃低溫下用0.25mL麥管封裝。將封裝好的細(xì)管精液至于冷藏架上，在4 ℃冰箱置留30 min，準(zhǔn)備在冷凍槽中采用液氮熏蒸冷凍。

1.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將采集的新鮮精液分為3份，第1份（對(duì)照組）精液不做離心處理；第2份（試驗(yàn)組1）為離心去除分精漿，精液按體積比1∶5加入基礎(chǔ)液稀釋后離心（1 250r／min、6 min），然后去掉一半上清；第3 份（試驗(yàn)組2）為離心完全去精漿組，精液按體積比1∶5加入基礎(chǔ)液稀釋，直接離心（1 250r／min、6min），反復(fù)離心3次，全部除去精漿。

1.7 精子品質(zhì)的檢測(cè)及指標(biāo)

冷凍細(xì)管從液氮罐中取出后，空氣浴5s，迅速投入38 ℃溫水中10s解凍。目測(cè)評(píng)估活力（簡(jiǎn)稱估測(cè)）：為便于在顯微鏡下計(jì)數(shù)，用移液槍取5μL待測(cè)精液，滴在載玻片，加上蓋玻片，置于顯微鏡下放大400倍檢查，計(jì)數(shù)一個(gè)視野下直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子與非直線運(yùn)動(dòng)精子的比例，求出活率。

精子頂體完整率的檢測(cè)：細(xì)管凍精解凍后，取10μL 精液滴于載玻片的左端，用另一張邊緣光滑的載玻片呈35°角自右面接觸液滴，拉向另一側(cè)，制成抹片。自然風(fēng)干5～10min后，用福爾馬林磷酸鹽固定液固定15 min，水洗干燥后，用姬姆薩染色90min，蒸餾水沖洗，干燥，在400倍顯微鏡下觀察300個(gè)精子，統(tǒng)計(jì)頂體完整的精子數(shù)。每次至少計(jì)算200個(gè)精子。

精子活率（%）＝直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)／總精子數(shù)×100%

精子頂體完整率（%）＝頂體完整的精子總數(shù)／所數(shù)總精子總數(shù)×100%

1.8 數(shù)據(jù)處理

各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 離心對(duì)隴東絨山羊精子活力的影響

隨機(jī)抽取不同批次中每個(gè)組別的9支細(xì)管檢驗(yàn)活率，各階段精子活率由表1可見。應(yīng)用基礎(chǔ)液洗滌法除去精漿后及在降溫平衡后，對(duì)照組、試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2 之間精子活率差異均不顯著（P ＞0.05）。但冷凍后試驗(yàn)組1與對(duì)照組、試驗(yàn)組2之間活率差異極顯著（P＜0.01），活率為33.41%，基本接近人工授精精子活率要求。

表1 不同處理后精子活率的比較

2.2 離心對(duì)隴東絨山羊精子頂體完整率的影響

抽取方法同上，由表2知，在離心后精子的頂體完整率相比差異不顯著（P＞0.05），降溫平衡后不同處理間頂體完整率差異顯著（P＜0.05），解凍后試驗(yàn)組2與對(duì)照組和試驗(yàn)組1相比差異顯著（P＜0.05）。

表2 不同處理后精子頂體完整率比較

2.3 離心對(duì)受體母羊受胎率的影響

細(xì)管凍精人工授精在環(huán)縣進(jìn)行，挑選散戶飼養(yǎng)的隴東絨山羊作為受體母羊，在自然發(fā)情條件，隨即抽取細(xì)管凍精，進(jìn)行人工授精（人工授精次數(shù)為一次）。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，細(xì)管凍精母羊受胎率對(duì)照組為46.15%，試驗(yàn)組1為49.33%，試驗(yàn)組2為46%，組間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同處理后細(xì)管凍精受胎率比較

3 討論

精液是由精子和精漿兩部分組成，兩者的成份分各不相同。精漿的成份分應(yīng)適合精子的生存，兩者之間要求取得一定平衡狀態(tài)，否則精子便受到損害。因此，充分了解精液的生理、生化特性和它們之間的相互關(guān)系，有助于研究精子在冷凍過程中的變化，以進(jìn)一步提高冷凍精液活力和受胎率。哺乳動(dòng)物的精漿充當(dāng)著精子載體，稀釋精子和為精子提供代謝物質(zhì)的功能，同時(shí)精漿某些蛋白質(zhì)成分，如去能因子、山羊卵黃凝結(jié)酶等，抑制精子的獲能、頂體反應(yīng)的發(fā)生、誘導(dǎo)頂體酶的提前釋放，從而影響精子活力和受胎率。因此，在精子的冷凍保存等體外處理過程中有必要對(duì)精漿的性質(zhì)加以考慮，對(duì)精漿的副作用了解，利于進(jìn)一步了解冷凍保存對(duì)精子造成的傷害及其原因，從而改進(jìn)冷凍保存方法，提高細(xì)管冷凍精液品質(zhì)。

在本研究中，除去部分精漿組后冷凍的精子活率、頂體完整率檢測(cè)指標(biāo)均優(yōu)于未離心組和完全除去精漿組，同時(shí)除去部分精漿組后受體母羊的受胎率高于其它組，這一結(jié)果同kisopatron和Ashworth的研究結(jié)果一致，這表明去除精漿后對(duì)冷凍后精子品質(zhì)有明顯提高作用；另外，Jasko等以500r／min離心18min除去稀釋過的精漿后可顯著提高馬的精子活力和運(yùn)動(dòng)速度。精漿中一些類似Zn2＋的自由離子、游離氨基酸及過氧化物之類也能削弱精子的一些生理功能，而通過離心處理也能降低此類成分的含量，從而提高精液的冷凍效果。保留部分精漿進(jìn)行降溫平衡處理，精漿中的一些有益蛋白質(zhì)成分也可能與精子膜結(jié)合，從而降低精子細(xì)胞膜在整個(gè)冷凍過程中遭受損傷機(jī)率，并有助于維持冷凍精子的膜完整性。一些研究認(rèn)為，除去精漿對(duì)提高精子品質(zhì)有利，但對(duì)不同除去精漿方法的效果卻存在不同觀點(diǎn)。在本研究中，利用離心法洗滌精液除去部分精漿，解凍后精液品質(zhì)試驗(yàn)組明顯優(yōu)于對(duì)照組。但Maxwell等認(rèn)為，離心會(huì)嚴(yán)重傷害精子，導(dǎo)致精子活力下降。Harrison提出在Ficoll液中離心可除去精漿并對(duì)精子的機(jī)械性損傷最小，這種損失隨離心力、離心液及離心后剩余精漿濃度而不同。本試驗(yàn)從凍后活率來看，明顯高于未離心的細(xì)管凍精；從受胎率來看，去除部分精漿的細(xì)管凍精高于為未離心的細(xì)管凍精。由此可見，1 250r／min離心法是一種有效的去除精漿途徑，提高隴東絨山羊細(xì)管凍精活率及受體母羊受胎率的有效方法。

［1］ 薛科邦，周步峰，張建軍，等.隴東優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)絨山羊選育的研究［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2011，30（3）：11-13.

［2］ 楊凌，桑潤(rùn)滋，張會(huì)文.羊精液冷凍保存技術(shù)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)草食動(dòng)，2004，24（1）：49-51.

［3］ 趙曉娥，王光亞，馬保華.布爾山羊細(xì)管冷凍精液研究初報(bào)［J］.西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，27（1）：19-22.

［4］ 馬毅.波爾山羊除精漿冷凍精液機(jī)理的研究［D］.陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2002.

［5］ 楊軍祥.除去精漿對(duì)波爾山羊冷凍精液品質(zhì)的影響［J］.中國(guó)草食動(dòng)物，2009，29（2）：22-24.

［6］ 朱士恩.家畜繁殖學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009.

［7］ Tulip K，Holtz W.Effect of glycerolization procedure and removal of seminal plasma on post-thaw survival and GOT release from boer goat spermatozoa［J］.Theriogenology，1994，42（3）：547-555.

［8］ Jiang Z L，Li Q W，Li W Y，et al.Effect of low density lipo-protein on DNA integrity of freezing-thawing boar sperm byneutral comet assay［J］.Animal Reproduction Science，2007，99（3-4）：401-407.

［9］ Centurion F，Vazquez J M，Calvete J J，et al.Influence of Porcine Spermadhesins on the Susceptibility of Boar Spermatozoa to High Dilution［J］.Biology of Reproduction，2003，69：640-646.

［10］ Garcia M A，Graham E F.Dialysis of bovine semen and its effect on fresh and freeze-thawed spermatozoa［J］.Cryobiology，1987，24（5）：446-454.

［11］ Manaskova P，Balinova P，Kraus M，et al.Mutual interactions of boar seminal plasma proteins studied by immuno-logical and chromatographic methods［J］.American Journal of Reproductive Immunology，2003，50（5）：399-410.

［12］ Maxwell W M C，Welch G R，Johnson L A.Aialility and membrane integrity of spermatozoa after dilution and flow cytometric sorting in the presence or absence of seminal plasma［J］.Reprod.Fertil.Develop，1997（8）：1165-1178.

［13］ Azeredo G A，Esper C R，Resende K T.Evaluation of plasma membrane integrity of frozen-thawed goat spermatozoa with or without seminal plasma［J］.Small Ruminant Research，2001（41）：257-263.

［14］ 楊凌，桑潤(rùn)滋，張樂穎，等.離心處理對(duì)波爾山羊凍精品質(zhì) 的 影 響［J］.湖 北 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)，2006，45（2）：223-225.