葉紅梅 鐘春燕 呂俊華*

(1廣州市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，廣東廣州510130;2暨南大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，廣東廣州510632)

記憶功能減退是認(rèn)知障礙的標(biāo)志癥狀，也是老年性癡呆的早期癥狀和主要特征。隨著人口老齡化和癡呆患病率的逐年增加，尋找有效的延緩和改善癡呆的藥物和方法顯得尤為重要。中藥荔枝核具有行氣散結(jié)，祛寒止痛之功效，荔枝核皂苷有歸肝腎經(jīng)、散寒行氣的功效，能調(diào)節(jié)人體糖、脂代謝、抗氧化和增強(qiáng)胰島素敏感性的作用，對(duì)RAGE的表達(dá)有一定影響。大量的資料事實(shí)證明:人體衰老存在學(xué)習(xí)記憶衰退和認(rèn)知障礙。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明，衰老與認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)［1-2］。但關(guān)于荔枝核改善學(xué)習(xí)記憶障礙方面未見(jiàn)報(bào)道;本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究荔枝核皂苷對(duì)D-半乳糖致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用與腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物作用及其可能的作用機(jī)制，為其用于改善老年性記憶障礙，延緩癡呆等相關(guān)性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料原料來(lái)源

1.1.1 荔枝核顆粒的制備 荔枝核經(jīng)廣東省農(nóng)科院果樹(shù)所荔枝研究室的專家鑒定的產(chǎn)自花都市花東鎮(zhèn)九一村王木海荔枝園的淮枝核作原材料。取荔枝核洗凈，破核后投料，加水煎煮2次，第1次加藥材用8倍的水，煎煮2 h，第2次加藥材用7倍的水，煎煮2 h，合并濾液，過(guò)滬，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度為1.25～1.30(60 ～65 ℃)的浸膏，檢驗(yàn)合格，取以上浸膏，蔗糖粉和藥用糊精混勻制備，過(guò)12目篩網(wǎng)制粒，烘干，顆粒檢驗(yàn)合格后分裝5 g/包，(廣東一方制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào):1101076)。

1.1.2 動(dòng)物 2月齡昆明種小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量(30±2)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK2009-0002，粵監(jiān)證字2009AO19。

1.1.3 藥品及試劑 D-半乳糖(Sigma公司，批號(hào):119k0103);石杉?jí)A甲(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)zl20101205);人神經(jīng)氨酸酶 (NA批號(hào):100050-201406);多巴胺(DA批號(hào):100070-211405);5-羥色胺(5-HT批號(hào):111656-2001101);5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA批號(hào):140737-2011501);二羥苯乙酸(DOPAC批號(hào):10130-201502);均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;水為超純水，乙腈為色譜純(德國(guó)默克公司)，其余試劑均為分析純。

1.1.4 儀器 Morris水迷宮(上海吉量有限公司);ES-2000型電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司);SMART video-tracking system(Panla公司);紫外分光光度計(jì)(美國(guó)珀金埃爾默公司)。庫(kù)侖陣列電化學(xué)高效液相色譜儀［Model 5600A-16通道檢測(cè)器(美國(guó) ESA公司)，Model 582 solvent Delivery System，Model 542自動(dòng)進(jìn)樣器，CoularrayWin工作站］，Dionex Tcc100型柱溫箱(美國(guó)戴安公司);Thermo D-37520型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司);pHS-25型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);GenPure超純水(德國(guó)TKA公司);KQ 500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，功率500 W，頻率40 kHz);3 K超濾管(PALL公司);BP211D電子天平 (德國(guó)Sartorious);佳美 SK-快速混勻器(江蘇金壇市佳美儀器廠);玻璃勻漿器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠模型的建立［3］小鼠皮下(sc)注射 D-半乳糖(500 mg/kg·d)連續(xù)8周，并以水迷宮測(cè)試確定學(xué)習(xí)記憶障礙模型的成立。注射容量為10 mL/kg體質(zhì)量。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，石杉?jí)A甲組(0.4 mg/kg)，荔枝核皂苷(15 g/kg)和高劑量組(60 g/kg)。除正常對(duì)照組外，上述各組動(dòng)物均給予D-半乳糖(500 mg/kg·d)造模，并于造模第5周開(kāi)始給予上述藥物灌胃，連續(xù)給藥4周，給藥容積同上。

1.2.3 Morris水迷宮測(cè)試［4］水迷宮直徑120 cm，高50 cm，站臺(tái)直徑9 cm，高30 cm，水面高于站臺(tái)1 cm，水中加入適量墨汁，使小鼠看不到平臺(tái)及池底。水池溫度維持在22～24°C。實(shí)驗(yàn)主要分為兩部分:一是定位航行實(shí)驗(yàn)，即設(shè)置平臺(tái)，每天灌胃后1 h，每只小鼠訓(xùn)練4次，按東、西 、南、北4個(gè)方向入水，小鼠面對(duì)池壁投入水中，記錄小鼠自入水到穩(wěn)定爬上平臺(tái)所需時(shí)間(即逃避潛伏期)。小鼠爬上站臺(tái)后讓其在上站立15 s，若入水后60 s內(nèi)未能找到站臺(tái)并站立15s，可將動(dòng)物放于站臺(tái)站立15 s后拿下來(lái)，休息30～60 s后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。二是空間探索實(shí)驗(yàn)，即撤除平臺(tái)，觀察小鼠在一定時(shí)間(30 s)內(nèi)穿越原平臺(tái)次數(shù)和停留原平臺(tái)所在象限時(shí)間百分比。從第7個(gè)實(shí)驗(yàn)日開(kāi)始，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠在原來(lái)位置站臺(tái)的象限逗留的時(shí)間及站臺(tái)穿越次數(shù)。

1.2.4 荔枝核皂苷對(duì)D-半乳糖誘致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙白天自主行為的影響［4］實(shí)驗(yàn)裝置為 15 cm×30 cm ×30 cm的箱 ，4周為黑色塑料板 ，箱底鋪以銅柵，銅絲直徑為2 mm，間距為5 mm，電流強(qiáng)度由一個(gè)可調(diào)變壓器控制 ，通以36V電流 ，箱內(nèi)右后側(cè)放置一個(gè)高和直徑均為415 cm的橡皮墊作為大鼠逃避電擊的安全區(qū)。將小鼠放入箱中自由活動(dòng)3 DOPAC和NA檢測(cè)按說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 荔枝核皂苷改善D-半乳糖誘致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用

模型組動(dòng)物定向航行潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.01);空間探索實(shí)驗(yàn)中，在原象限停留時(shí)間和站臺(tái)穿越次數(shù)明顯減少(P＜0.01);荔枝核皂苷和石杉?jí)A甲處理后，定向航行潛伏期明顯縮短(P＜0.01)，而在原象限停留時(shí)間與模型組比較略有增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但低劑量荔枝核組明顯增加站臺(tái)穿越次數(shù)明顯增加(P＜0.05)見(jiàn)表1。

2.2 荔枝核皂苷對(duì)D-半乳糖誘致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙白天自主行為的影響

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠白天自主行為平均活動(dòng)速度變慢，休息時(shí)間增加，快運(yùn)動(dòng)時(shí)間做短，忙運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)(P ＜0.05，P ＜0.01)。荔枝核處理后，平均活動(dòng)速度略有增加，但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但可明顯縮短休息時(shí)間和增加快運(yùn)動(dòng)時(shí)間(P＜0.01)。見(jiàn)表2。

2.3 荔枝核皂苷對(duì)D-半乳糖誘致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙夜間自主行為的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組夜間平均速度明顯減少，休息時(shí)間明顯延長(zhǎng)，快運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯縮短(P＜0.01)。與模型對(duì)照組相比，荔枝核皂苷處理后，可增加平均速度，尤其是低劑量組作用明顯(P＜0.01)，而對(duì)休息時(shí)間和快慢運(yùn)動(dòng)影響較小。見(jiàn)表3。min，熟悉環(huán)境，然后箱底通以電流 ，其正常反應(yīng)是跳上平臺(tái)以躲避傷害性刺激。記錄自放入至第1次跳下平臺(tái)受電擊的時(shí)間為潛伏期及5 min內(nèi)跳下平臺(tái)受電擊的次數(shù)為錯(cuò)誤數(shù)，作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24 h后，再將鼠置于平臺(tái)上依上法記錄作為記憶縮短休息時(shí)間和增加快運(yùn)動(dòng)成績(jī)。

1.2.5 荔枝核皂苷對(duì)D-半乳糖誘致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙夜間自主行為的影響［4］實(shí)驗(yàn)裝置為 15 cm×30 cm ×30 cm的箱 ，4周為黑色塑料板 ，箱底鋪以銅柵，銅絲直徑為2 mm，間距為5 mm，電流強(qiáng)度由一個(gè)可調(diào)變壓器控制 ，通以36V電流 ，箱內(nèi)右后側(cè)放置一個(gè)高和直徑均為415 cm的橡皮墊作為大鼠逃避電擊的安全區(qū)。實(shí)驗(yàn)夜間進(jìn)行自主行為將小鼠放入箱中自由活動(dòng)3 min，熟悉環(huán)境，然后箱底通以電流，其正常反應(yīng)是跳上平臺(tái)以躲避傷害性刺激。記錄自放入至第1次跳下平臺(tái)受電擊的時(shí)間為潛伏期及5 min內(nèi)跳下平臺(tái)受電擊的次數(shù)為錯(cuò)誤數(shù)，作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24 h后，再將鼠置于平臺(tái)上依上法記錄作為記憶夜間進(jìn)行自主行為縮短休息時(shí)間和增加快運(yùn)動(dòng)成績(jī)。

1.2.6 荔枝核皂苷對(duì)D-半乳糖誘致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用的抗糖基化機(jī)制［5］處死小鼠獲取血清及腦組織，稱大腦按1∶9加入冷生理鹽水制成濃度為10%的小鼠腦組織勻漿液，按晚期糖基化產(chǎn)物、血清果糖胺、血清糖化血紅蛋白水平和AGEs的形成及腦組織內(nèi)的糖基化產(chǎn)物含量;檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作測(cè)定。

1.2.7 荔枝核皂苷D-半乳糖誘致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用與腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)系［6］采用高效液相庫(kù)侖陣列電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化，稱小鼠大腦按1∶9加入冷生理鹽水勻漿，按腦內(nèi)5-HT、5-HIAA、DA、

表1 荔枝核提取物對(duì)D-半乳糖致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響(±s，n=10)

表1 荔枝核提取物對(duì)D-半乳糖致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響(±s，n=10)

注:與正常對(duì)照組比較:a P＜0.01;與模型組比較:b P＜0.05

組別 劑量(g/kg·d)定向航行潛伏期(s)空間探索原象限停留時(shí)間(s) 站臺(tái)穿越(次)24.36 ±7.51 48.28 ±8.02 1.90 ±0.88模型組 － 44.63±4.76a 33.76±5.37a 0.70±0.48a石杉?jí)A甲組 0.4 mg 37.46 ±9.23b 35.20 ±4.71 0.90 ±0.57b荔枝核(高) 60 40.30 ±7.21b 34.09 ±7.88 0.80 ±0.35荔枝核(低) 15 35.50 ±7.76b 37.48 ±5.29 1.00 ±0.67正常對(duì)照組 －b

2.4 荔枝核皂苷對(duì)D-半乳糖誘致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用的抗糖基化機(jī)制

模型組大鼠的AR活性明顯高于正常組(P＜0.01);荔枝核皂苷給藥后，均明顯降低D-半乳糖處理后引起的AR活性增高(P＜0.05)。同時(shí)，荔枝核皂苷高、中劑量組明顯降低晚期糖基化產(chǎn)物，如血清果糖胺、血清糖化血紅蛋白水平和AGEs的形成及腦組織內(nèi)的糖基化產(chǎn)物(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

2.5 荔枝核皂苷D-半乳糖誘致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用與腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)系

采用高效液相庫(kù)侖陣列電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化，由表5可見(jiàn)，模型組與正常對(duì)照組相比腦內(nèi)5-HT、5-HIAA、DA、DOPAC和NA含量差異(P＞0.05)。各給藥組與模型對(duì)照組相比，上述單胺類遞質(zhì)含量亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);見(jiàn)表5。

表2 荔枝核提取物對(duì)D半乳糖誘致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠白天自主活動(dòng)的影響(ˉx±s，n=10)

表3 荔枝核皂苷對(duì)D半乳糖誘致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠夜間自主活動(dòng)的影響(ˉx±s，n=10)

表4 荔枝核提取物對(duì)D-半乳糖誘致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙時(shí)的AR活性和糖化產(chǎn)物的影響(ˉx±s，n=10)

表5 荔枝核皂苷對(duì)D-半乳糖誘致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響(ˉx±s，n=10)

3 討論

老年性癡呆(A lzheimer氏病，AD)約占老年期癡呆的50%，記憶力減退和人格改變是本病最早出現(xiàn)的癥狀。近年來(lái)，隨著對(duì)記憶障礙的腦生化機(jī)理的研究，認(rèn)為其主要與中樞神經(jīng)遞質(zhì)代謝有關(guān)，且累及多種神經(jīng)遞質(zhì)［7］。至于AD的腦內(nèi)膽堿能改變已成定論。AD患病與神經(jīng)元的退化、死亡、膽堿能功能衰竭密切相關(guān)。應(yīng)用膽堿酯酶抑制劑而提升膽堿能功能可取得最為有效的對(duì)癥治療效果［8］。

本研究在D-半乳糖致衰老的基礎(chǔ)上，行側(cè)腦室注入Aβ造成 AD模型小鼠，使其學(xué)習(xí)記憶變化及病理變化與AD更為相似，并以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步研究荔枝核提取物對(duì)AD的防治作用。Morgon［9］等5-羥色胺:5-羥色胺(5-HT)是維持正常智能的重要遞質(zhì)，與5-羥色胺能系統(tǒng)密切相關(guān)的是中逢核。以前認(rèn)為5-HT及其代謝產(chǎn)物5-吲哚乙酸未見(jiàn)有與年齡相關(guān)的變化，中逢核細(xì)胞脫落不嚴(yán)重。后來(lái)日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)5-HT雖對(duì)記憶過(guò)程本身無(wú)效，但在動(dòng)物學(xué)習(xí)前1h給與5-HT或在學(xué)習(xí)后海馬區(qū)注射5-HT，均可引起記憶障礙。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)AD患者5-HT系統(tǒng)也嚴(yán)重?fù)p害，表現(xiàn)為5-HT和5-羥吲哚乙酸濃度下降，其受體結(jié)合點(diǎn)減少;發(fā)現(xiàn)AD病人與正常人相比5-HT濃度下降受體數(shù)量減少。

本研究采用多種行為藥理學(xué)方法檢測(cè)由所致記憶障礙小鼠及D-半乳糖動(dòng)物模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可證明了荔枝核皂苷對(duì)記憶獲得、記憶鞏固及記憶再現(xiàn)障礙有明確的改善記憶功能，并對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠所致癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶低下亦有顯著的作用，荔枝核皂苷明顯改善模型小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力;并證實(shí)了荔枝核提取物對(duì)小鼠白天自主行為的平均活動(dòng)速度略有增加，但與模型組比較無(wú)顯著差異，可明顯縮短休息時(shí)間和增加快運(yùn)動(dòng)時(shí)間。而夜間自主行為，可增加平均速度，尤其是低劑量組作用更明顯;而對(duì)休息時(shí)間和快慢運(yùn)動(dòng)影響較小。各給藥組與模型對(duì)照組相比單胺類遞質(zhì)含量亦無(wú)明顯變化。因而從藥效學(xué)角度看來(lái)，荔枝核提取物具有改善D-半乳糖誘致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用;其作用可能與其減少抑制對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用有關(guān)，但其確切的作用機(jī)理有待于研究。

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