鄭曉冬 宋燁 潘少香 孟曉萌 劉雪梅 閆新煥

（中華全國供銷合作總社濟(jì)南果品研究院，山東濟(jì)南250014）

高效液相色譜法檢測紅棗中苯甲酸

鄭曉冬 宋燁 潘少香 孟曉萌 劉雪梅 閆新煥

（中華全國供銷合作總社濟(jì)南果品研究院，山東濟(jì)南250014）

本文建立了一種水溶液直接浸提結(jié)合高效液相色譜法檢測紅棗中苯甲酸的方法。采用剪切-均質(zhì)-超聲相結(jié)合的方式提取紅棗中的苯甲酸，比較選擇了液相色譜流動相類型與配比，檢測了紅棗樣品中苯甲酸的含量，并進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，以甲醇:水（含0.15%乙酸銨）=5:95時(shí)，苯甲酸出峰鋒型最佳，保留時(shí)間合適，分析速度快。該方法對苯甲酸的提取效率高，回收率在78.8%～105%之間，精密度在4.87%～5.42%之間。方法線性良好（2=0.9990），靈敏度高，測定下限為1.5mg/kg，可滿足紅棗中苯甲酸的檢測需求。

紅棗；苯甲酸；高效液相色譜

苯甲酸是一種使用較為廣泛的食品添加劑，常用于食品防腐、延長貨架期。但過量食用可誘發(fā)癌癥，長期使用可誘發(fā)哮喘、蕁麻疹及血管性水腫等變態(tài)反應(yīng)，對人體健康造成不利影響[1-3]。國家標(biāo)準(zhǔn)對于苯甲酸在食品中的添加有嚴(yán)格限制，而且在部分食品中禁止使用?！妒称诽砑觿┦褂眯l(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760）中規(guī)定，紅棗中不能含有苯甲酸。然而，在紅棗的實(shí)際生產(chǎn)加工中往往能檢測出苯甲酸，該問題長期以來一直困擾著紅棗加工企業(yè)及廣大消費(fèi)者。

紅棗中苯甲酸的來源（外來添加還是自然生成）則是該問題的焦點(diǎn)。國內(nèi)外學(xué)者曾報(bào)道過其他水果、蔬菜、堅(jiān)果中自然存在苯甲酸[4-6]，如成熟的紅莓、青梅、李等約含0.05%的苯甲酸。Sibee等對某些食品中檢出的苯甲酸結(jié)果如下：土豆、蠶豆0.2mg/kg；水果0～14mg/kg；堅(jiān)果、黃豆1.2～11mg/kg[7,8]；Hbarnore也曾報(bào)道過蘋果在被真菌感染后也會自然產(chǎn)生苯甲酸。由于果蔬中天然生成的苯甲酸含量較低，為了探究天然苯甲酸含量，則需要建立一種檢出限更低，準(zhǔn)確性更高的檢測方法。

目前，食品中苯甲酸的檢測通常依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中山梨酸苯甲酸的測定》（GB/T 5009.29-2003）進(jìn)行，也有大量文獻(xiàn)報(bào)道了各類食品中苯甲酸液相色譜檢測方法[9-13]。然而，未有高效液相色譜法檢測紅棗中苯甲酸的相關(guān)報(bào)道。紅棗作為一種特殊的核果類果品，含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，最為顯著的是多糖占到51.4%～66.5%[14,15]。這就導(dǎo)致其果肉粘性大，前處理困難。單純采用國標(biāo)方法來檢測分析并不十分適用。本文針對高含糖量紅棗樣品，采用剪切-均質(zhì)-超聲相結(jié)合的提取方式，優(yōu)化了高效液相色譜法檢測紅棗中的苯甲酸的條件與參數(shù)。同時(shí)，對市場中幾種紅棗產(chǎn)品中的苯甲酸進(jìn)行了分析調(diào)研。旨在為紅棗中苯甲酸的檢測提供一種快速、可靠、準(zhǔn)確的方法，積累一些不同紅棗品種中苯甲酸含量及分布特點(diǎn)等基礎(chǔ)信息。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

灰棗1，產(chǎn)自新疆若羌縣，樂陵市賽福佳棗業(yè)有限公司；

灰棗2，產(chǎn)自新疆，濟(jì)南萬福樂食品有限公司；

駿棗1，產(chǎn)自新疆和田，好想你棗業(yè)股份有限公司；

駿棗2，產(chǎn)自新疆，新疆本草堂中藥飲片有限公司。

甲醇，色譜純；乙酸銨，色譜純；苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，島津LC-10AT，配紫外檢測器和色譜工作站；

高速離心機(jī)，德國Labofuge A；

均質(zhì)機(jī)，德國T18basic；

超純水儀，明澈D24 UV，0.45μm水膜過濾頭。

1.3 方法

1.3.1 樣品的提取

用剪刀將紅棗果肉剪碎至直徑為0.2～0.5cm大小的顆粒，準(zhǔn)確稱量5.00g，加蒸餾水混合，經(jīng)均質(zhì)機(jī)均質(zhì)到無明顯顆粒，然后超聲處理5min，再用氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)為弱堿性，準(zhǔn)確定容到50mL。取上層清液經(jīng)0.45μm水膜過濾，得到樣品提取液，待測[16]。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：C18（250mm×4.6mm，5μm）；

流動相：甲醇:水（含0.15%乙酸銨）=5:95；

洗脫模式：等度洗脫；

洗脫速率：1.0mL/min；

檢測器：紫外檢測器，波長為230nm；

進(jìn)樣量：20μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相及流速

通過優(yōu)化對比流動相中有機(jī)相比例、水相溶液中乙酸銨的含量及流速，確定了最佳的色譜實(shí)驗(yàn)條件甲醇∶水（含0.15%乙酸銨）=5∶95，流速為1.0mL/min。在此條件下苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液出峰時(shí)間快，峰型好（見圖1）。圖2為實(shí)際紅棗樣品中苯甲酸色譜圖，出峰時(shí)間較為適宜，且未收到紅棗提取液中其他組分的干擾。

圖1 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（濃度為20mg/L）Fig.1 The chromatograms of benzoic acid standard solution (concentration 20mg/L)

圖2 新疆灰棗中苯甲酸檢測色譜圖Fig.2 The chromatograms of benzoic acid in Xinjiang Huizao

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限

配置系列不同濃度苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣后利用色譜工作站繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3，線性良好R2=0.9990。再選擇合適的基線噪音范圍，計(jì)算苯甲酸的信噪比，根據(jù)信燥比S/N=3計(jì)算儀器檢出限為0.05mg/L，信燥比S/N=10計(jì)算儀器檢測限為0.15mg/L（即為測定下限），再根據(jù)苯甲酸在前處理過程中的最終定容體積，通過計(jì)算得到該方法的檢測限1.5mg/kg。

圖3 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 Standard curve of benzoic acid

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 加標(biāo)回收率

為驗(yàn)證該方法提取苯甲酸的準(zhǔn)確性，分別對研究中選用的4種紅棗進(jìn)行了加標(biāo)回收率的測定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，采用該處理方式，提取紅棗中苯甲酸，回收率分別為92.0%～105%、87.0%～103%、 78.8%～95.0%和80.9%～100%之間，回收率較高，可滿足紅棗樣品中苯甲酸定量檢測分析。

表1 加標(biāo)紅棗樣品中苯甲酸測定結(jié)果（n=3）Table 1 Determination result of benzoic acid in spiked jujube sample（n=3）

2.3.2 精密度

為了考察方法的穩(wěn)定性，選用新疆灰棗與新疆駿棗分別進(jìn)行5次平行處理，提取苯甲酸進(jìn)行測定，結(jié)果見表2，新疆灰棗1與新疆駿棗1進(jìn)行5次平行處理測定結(jié)果計(jì)算精密度分別為4.87%和5.42%。

表2 紅棗樣品中苯甲酸測定結(jié)果（n=5）Table 2 Determination result of benzoic acid in jujube sample（n=5）

2.4 紅棗產(chǎn)品的檢測

本研究選用了市場上比較常見4種新疆紅棗產(chǎn)品，對其進(jìn)行分析檢測，均有不同程度苯甲酸檢出，如新疆灰棗中苯甲酸含量為25.6mg/kg和39.1mg/kg，新疆駿棗中苯甲酸含量為101mg/kg和104mg/kg，明顯高于灰棗中苯甲酸含量。這種含量水平顯著低于《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760-2014）中規(guī)定的苯甲酸添加濃度限量，然而《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》未對紅棗產(chǎn)品中苯甲酸做限量規(guī)定，即為紅棗產(chǎn)品中不得添加（或檢出）苯甲酸。已有文獻(xiàn)報(bào)道果蔬產(chǎn)品中可天然生成苯甲酸[17,18]，并有研究人員繪制了天然苯甲酸的生成途徑，探討了生成的機(jī)制[19,20]。紅棗中苯甲酸的檢出不僅為下一步食品安全標(biāo)準(zhǔn)的制修訂提供了一份重要的素材，更為食品安全產(chǎn)業(yè)發(fā)展拋出了一個(gè)新課題。

3 結(jié)論

本研究建立了一種以水溶液直接浸提高效液相色譜法檢測紅棗中苯甲酸的方法。采用剪切-均質(zhì)-超聲三種方式相結(jié)合的提取方法，快速、有效的提取了紅棗中的苯甲酸，以甲醇：水（含0.15%乙酸銨）=5∶95時(shí)苯甲酸出峰峰型最佳，且分析速度快。對實(shí)際紅棗樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)與重復(fù)性檢測，結(jié)果顯示，該處理方式對苯甲酸回收率穩(wěn)定，精密度高，方法線性良好，方法測定下限可滿足紅棗樣品中苯甲酸的檢測需求，為準(zhǔn)確快速掌握紅棗樣品中苯甲酸含量水平、進(jìn)一步探究紅棗中苯甲酸成因提供了更可靠的分析手段。

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Determination of Benzoic Acid in Jujube by High Performance Liquid Chromatography

ZHENG Xiao-dong SONG Ye PAN Shao-xiang MENG Xiao-meng LIU Xue-meiYAN Xin-huan
(Jinan Fruit Research Institute,All China Federation of Supply&Marketing Co-operatives,Jinan 250014,China)

In the paper,a water direct extraction combined HPLC method was developed for the determination of benzoic acid in jujube.The combination pretreatment of cut-homogenization-ultrasound was adopted.Different influencing factors such as the proportion of mobile phase were studied.Based on this,real samples determination and recovery experiments were carried out.The result showed that the the mobile phases were methanol and 0.15%ammonium acetate aqueous solution(5:95,v/v).Under these conditions,the peak shape was presented well with an appropriate retention time and rapid measurement.The recoveries were 78.8%～105%,and the RSDs were 4.87%～5.42%.The linearity is good in detection(2= 0.9990),and LOQ (=10)was 1.5mg/kg.This method can meet the need for the quantitative detection of benzoic acid in jujube.

Jujube;benzoic acid;high performance liquid chromatography(HPLC)

TS255.3

A

1008-1038(2015)10-0033-04

2015-03-21

國家科技支撐計(jì)劃課題棗和桑資源生態(tài)高值利用技術(shù)研究與產(chǎn)品開發(fā)(2012BAD36B07）

鄭曉冬（1983—），男，助理研究員，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全與控制