于 婭， 潘 嘉， 吳建明， 李利民， 李 翔， 鄒文俊， 秦旭華*

（1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川成都610075；2.四川省中醫(yī)藥科學院，四川成都610041；3.瀘州醫(yī)學院藥學院，四川瀘州646000；）

鞣花酸體外抗人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞血管生成

于 婭1， 潘 嘉2， 吳建明3， 李利民2， 李 翔1， 鄒文俊1， 秦旭華1*

（1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川成都610075；2.四川省中醫(yī)藥科學院，四川成都610041；3.瀘州醫(yī)學院藥學院，四川瀘州646000；）

目的觀察鞣花酸體外抗人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVEC）血管生成作用，以及對PDGFB，JAK/STAT表達的影響。方法采用SRB法、劃痕法及Matrigel體外成管實驗分別考察鞣花酸對HUVEC增殖、遷移及小管形成的影響；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈（RT-PCR）法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）法、免疫印跡法（Western blot）分別觀察鞣花酸對HUVEC細胞PDGFB mRNA表達、對細胞上清中PDGFB分泌及對細胞中PDGFB、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平的影響。結(jié)果鞣花酸能顯著抑制HUVEC增殖、遷移和小管形成 （P＜0.01或P＜0.05），其增殖抑制作用呈時間和濃度依賴性，遷移和小管形成抑制作用呈劑量依賴性。同時，鞣花酸能顯著降低PDGFB基因和蛋白表達水平 （P＜0.01或P＜0.05），降低STAT3蛋白的磷酸化水平（P＜0.01或P＜0.05），而對STAT3蛋白表達總量無變化。結(jié)論鞣花酸可能通過下調(diào)內(nèi)皮細胞中PDGFB的表達并進一步抑制下游STAT3蛋白磷酸化來抑制血管生成。

鞣花酸；人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVEC）；血管生成；；PDGFB；STAT3

鞣花酸 （EA）是一種由兩分子沒食子酸聚合形成的小分子多酚，分布于薔薇科、大戟科、石榴科等多種植物，尤其在五倍子、石榴、地榆等多種中藥中含量豐富。近年來研究表明，鞣花酸具有良好的抗腫瘤作用，體外抑制多種腫瘤細胞的生長［1-2］，進一步的研究表明，其抗腫瘤作用可能與抗腫瘤血管生成有關［3-4］。但前期關于鞣花酸抗腫瘤新生血管生成研究主要針對血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）途徑，對血小板衍生因子（platelet-derived growth factor，PDGF）的表達及其關聯(lián)的新生血管研究尚未見報道，更未見對其下游信號途徑的研究。PDGFB是PDGF的一個亞型，與細胞膜上的受體結(jié)合激活細胞內(nèi)JAK/STAT（janus kinase-signal transduction and transcription activator）等信號通路發(fā)揮抗血管生成作用，與腫瘤新生血管新生的關系密切。因此本研究采用人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVEC）為模型，觀察鞣花酸體外抗血管生成作用，探討其基于PDGFB、JAK/STAT信號途徑的作用機理。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 鞣花酸對照品 （純度≥98%，批號00411117，成都瑞芬思生物科技有限公司）；人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVEC）、內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基（美國Sciencell公司）；Matrigal基質(zhì)膠（批號2195739，美國BD公司）；PDGFB、GAPDH引物（上海生工生物工程技術服務有限公司，引物序列見表1）；One-step RT-PCR試劑盒（批號AK1301，大連寶生物工程有限公司）；人血小板衍化生長因子B（PDGF-B）ELISA試劑盒（批號E00951，上海碩聯(lián)生物科技有限公司）；胞漿和核蛋白提取試劑盒 （批號20140704，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；PDGFB（批號B2013）、STAT3（批號10913）、p-STAT3（Tyr705，批號F0413）、β-actin抗體 （批號F2112，美國Santa Cruz公司）；山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG，批號112438，北京中杉金橋生物技術有限公司）。CO2培養(yǎng)箱 （日本Sanyo公司）；倒置相差顯微鏡 （日本Nikon公司）；多功能酶標儀（美國PerkinElmer公司）、PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用EGM培養(yǎng)基（含5%新生胎牛血清、雙抗、ECGS），于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HUVECs細胞，2～3 d更換一次培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 SRB法檢測HUVEC增殖能力 細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，5 000個/孔，次日更換新鮮培養(yǎng)基并加藥，陽性藥索拉菲尼 （簡寫為saf）終濃度為10μmol/L，鞣花酸終質(zhì)量濃度為20、10、5 μg/mL，同時設置空白組，每組6個復孔，常規(guī)培養(yǎng)。分別于0、24、48、72 h每孔加入50μL TCA溶液4℃固定細胞1 h，去離子水沖洗5遍，晾干；每孔加入0.4%的SRB染色液50μL，室溫染色30 min，1%乙酸沖洗5次，晾干；每孔加入Trisbase堿液200μL，室溫搖床充分溶解，540 nm處測吸光度。細胞增殖百分率=［（TX-T0）/（C-T0）］× 100%，其中TX為藥物作用終點的平均吸光度，T0為藥物作用前的平均吸光度，C為空白組終點的平均吸光度。

1.2.3 劃痕法檢測HUVEC遷移能力 鋪板前，在培養(yǎng)板的背面用marker筆均勻地劃3道橫線。細胞接種于6孔板中，30萬/孔，8 h后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，過夜饑餓細胞 （加含2%FBS、雙抗的培養(yǎng)基）。次日，吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次。直尺比著，用無菌的槍頭在每孔細胞生長單層相同位置，與板底橫線垂直地做一道劃痕，PBS輕輕沖洗劃去的細胞，加入新鮮饑餓培養(yǎng)基并加藥。索拉菲尼終濃度為5μmol/L，鞣花酸終質(zhì)量濃度分別為20、10、5μg/mL，同時設空白組。直線與劃痕相交處作為劃痕寬度測量點，40×拍照，每孔3張。20 h后，測量點處拍照，方法同0 h。IPP軟件處理圖片，計算劃痕寬度，每組平均值作為該孔劃痕寬度，重復3次。遷移距離為0 h劃痕寬度減去20 h劃痕寬度。

1.2.4 Matrigel體外成管實驗檢測HUVEC小管形成能力 基質(zhì)膠4℃過夜融化，預冷的無血清培養(yǎng)基1∶1稀釋基質(zhì)膠，50μL/孔鋪于96孔培養(yǎng)板中，37℃使其充分凝固備用。將含藥的細胞懸液接種于基質(zhì)膠包被好的培養(yǎng)板中，索拉菲尼終濃度為10μmol/L，鞣花酸終質(zhì)量濃度分別為20、10、5μg/mL，同時設置空白組，每組3個復孔，常規(guī)培養(yǎng)。6 h后，40×鏡下觀察并拍照，每孔隨機選擇3處拍照，IPP軟件計算小管長度，平均值作為該組小管長度，重復3次。

1.2.5 RT-PCR法檢測HUVEC中PDGFB mRNA的表達 細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，次日更換饑餓培養(yǎng)基，4 h后更換完全培養(yǎng)基并加藥，鞣花酸終質(zhì)量濃度分別為20、10、5μg/mL，同時設置空白組。16 h后采用Trizol試劑提取細胞總RNA，參照RT-PCR試劑盒說明書擴增目的基因，序列：正向5'-TGCGGA AGA CAA TCT-3'，反向5'-TAA ATA ACC CTG CCC ACA CAC T-3'。反應條件：50℃、30 min（逆轉(zhuǎn)錄）；94℃、2 min，94℃、30 s，56℃、30 s（擴增），28個循環(huán)；72℃、5 min（最后延伸）。同時設置內(nèi)參基因GAPDH的擴增。產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，拍照，Quantity One軟件分析灰度值，采用半定量方法 （目的基因/GAPDH）計算目的基因表達水平。

1.2.6 ELISA檢測HUVEC上清中PDGFB蛋白的分泌 接種及加藥方法同 “1.2.5”項，加藥24 h后吸取上清，2 000 r/min離心15 min，取上清按試劑盒說明書進行ELISA實驗，每組設置3個復孔，平均值作為該組的吸光度。

1.2.7 Western blot檢測HUVECs中PDGFB、STAT3、p-STAT3蛋白的表達 接種及加藥方法同“1.2.5”項，加藥24 h后按試劑盒說明書提取胞漿蛋白；BCA法測定蛋白濃度；變性后進行SDSPAGE電泳；將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5%脫脂奶粉室溫搖床上封閉2 h，PBST洗膜3次，每次10 min；加入用PBST稀釋的PDGFB（1∶500）、STAT3（1∶1 000）或p-STAT3（1∶500）抗體，4℃過夜孵育，次日PBST洗膜3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，PBST洗3次，每次10 min；ECL發(fā)光，Quantity One軟件分析灰度值。

1.2.8 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用以均數(shù)±標準差（x±s）表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包處理，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05則表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 鞣花酸對HUVEC的增殖影響 隨著鞣花酸質(zhì)量濃度的增加，細胞增殖率降低 （P＜0.01或P＜0.05），呈現(xiàn)劑量依賴性。隨著鞣花酸作用時間增長，細胞的增殖率降低，呈現(xiàn)時間依賴性。陽性藥索拉菲尼HUVEC的增殖率小于鞣花酸各劑量組，見表2。

2.2 鞣花酸對HUVEC的遷移能力的影響 與空白組比較，鞣花酸20、10、5μg/mL劑量組HUVEC細胞的遷移距離顯著縮短 （P＜0.01），且隨著藥物質(zhì)量濃度增加，細胞的遷移距離降低，鞣花酸對HUVEC遷移能力的抑制作用呈劑量依賴性，見表3，圖1。

2.3 鞣花酸對HUVECs的小管形成的影響 與空白組比較，鞣花酸20、10、5μg/mL劑量組HUVEC細胞形成的小管總長度顯著降低 （P＜0.01），且隨著藥物質(zhì)量濃度增加，小管總長度降低，鞣花酸對HUVEC細胞小管形成能力的抑制作用呈劑量依賴性?？瞻捉M細胞能相互連接，形成較多、較長的 “管道樣”結(jié)構，而鞣花酸處理后，細胞形成“管道樣”結(jié)構能力減弱，小管較短且不連續(xù)，見表4、圖2。

表3 鞣花酸對HUVEC遷移的影響（x±s，n=3）Tab.3 Effect of EA on the m igration of HUVEC in vitro（x±s，n=3）

圖1 鞣花酸對HUVEC遷移的影響Fig.1 Effect of EA on them igration of HUVEC in vitro

表4 鞣花酸對HUVEC小管形成的影響（x±s，n=3）Tab.4 Effect of EA on the tube formation of HUVEC in vitro（x±s，n=3）

圖2 鞣花酸對HUVEC小管形成的影響Fig.2 E ffect of EA on tube formation of HUVEC in vitro

2.4 鞣花酸對HUVEC中PDGFBmRNA表達的影響 與空白組比較，鞣花酸20、10μg/mL劑量組PDGFB條帶明顯變暗。半定量分析結(jié)果顯示，鞣花酸20、10μg/mL劑量組PDGFBmRNA表達水平下降（P＜0.01），鞣花酸5μg/mL劑量組無顯著抑制作用，各組內(nèi)參基因GAPDH條帶基本一致，見表5、圖3。

2.5 鞣花酸對HUVEC上清中PDGFB分泌的影響

與空白組比較，鞣花酸20、10μg/mL劑量組HUVEC細胞培養(yǎng)上清液中PDGFB水平下降（P＜0.01），鞣花酸5μg/mL劑量組無顯著抑制作用，見表6。

表5 鞣花酸對HUVEC細胞PDGFB m RNA表達的影響（x±s，n=3）Tab.5 E ffect of EA o on them RNA expression of PDGFB（x±s，n=3）

圖3 鞣花酸對HUVEC細胞PDGFB m RNA表達的影響Fig.3 Effect of EA on themRNA expression of PDGFB

表6 鞣花酸對HUVEC上清中PDGFB分泌的影響（x± s，n=3）Tab.6 Effect of EA on the secretion of PDGFB（x±s，n=3）

2.6 鞣花酸對HUVEC中PDGFB、p-STAT3、STAT3表達的影響 鞣花酸20、10、5μg/m L劑量組PDGFB蛋白條帶減弱，20、10μg/mL劑量組p-STAT3蛋白條帶減弱。半定量灰度值分析結(jié)果顯示，鞣花酸20、10、5μg/mL劑量組PDGFB蛋白表達水平均顯著下降 （P＜0.01或P＜0.05），同時鞣花酸20、10μg/mL劑量組p-STAT3水平顯著下降 （P＜0.01或P＜0.05），鞣花酸各劑量組對STAT3蛋白表達水平無影響，各組管家蛋白β-actin條帶基本一致，見表7、圖4。

3 討論

近年來，從天然植物或中藥中尋找新型抗腫瘤血管生成單體成分是抗腫瘤研究的熱點，許多中藥單體成分顯示具有良好的抗血管生成作用，包括葫蘆素E［5］、百里香醌［6］、人參皂苷Rg3［7］等。本研究結(jié)果表明，鞣花酸體外能顯著抑制HUVEC細胞增殖、遷移、成管3個重要環(huán)節(jié)從而發(fā)揮抗血管生成作用。

表7 鞣花酸對HUVEC細胞中PDGFB、p-STAT3、STAT3表達的影響（x±s，n=3）Tab.7 Effect of EA on the expressionof PDGFB，p-STAT3，STAT3（x±s，n=3）

圖4 鞣花酸對HUVEC細胞中PDGFB、p-STAT3、STAT3表達的影響Fig.4 Effect of EA o on the expression of PDGFB，p-STAT3，STAT3

血管的新生是一個連續(xù)、復雜的過程，主要包括①細胞外基質(zhì)的降解；②血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和小管形成；③血管平滑肌細胞和周細胞 （合成為壁細胞）的增殖、遷移并包圍血管內(nèi)皮細胞進而形成穩(wěn)定成熟的新生血管。PDGFB作為重要的促血管生成因子，其主要通過以下三個方面發(fā)揮促血管生成作用：第一，作用于血管內(nèi)皮細胞，促進其增殖、遷移及小管形成［8］；第二，與VEGF、bFGF等促血管生成因子發(fā)揮協(xié)同作用［9］；第三，PDGFB促進壁細胞的增殖［10-11］，募集其向新生血管遷移，包圍血管內(nèi)皮細胞，進一步形成成熟和穩(wěn)定的新生血管網(wǎng)壁［12］。同時也有研究表明［13］，即使血管內(nèi)皮細胞凋亡，壁細胞也能在PDGFB等促血管生成因子的作用下單獨開啟血管生成效應。STAT家族包括STAT1-6，其中STAT3在PDGFB介導的血管新生中發(fā)揮重要作用。PDGFB與其受體結(jié)合，引發(fā)受體磷酸化并形成二聚體，激活細胞內(nèi)JAK/STAT途徑，并進一步激活STAT3磷酸化（p-STAT3）形成活性形式，轉(zhuǎn)入細胞核調(diào)節(jié)血管生成因子的表達，從而介導血管新生。本研究結(jié)果表明，鞣花酸組PDGFB基因和蛋白的表達下降，同時p-STAT3水平下降，提示鞣花酸可能通過抑制PDGFB表達，進一步抑制STAT3磷酸化發(fā)揮抗血管生成作用。

Wang、Zhao等［3-4］研究表明，鞣花酸通過抑制VEGF的表達、VEGFR的磷酸化，進一步抑制下游Ras-MARK信號途徑中JNK、ERK、AKT的磷酸化發(fā)揮抗血管生成作用。本研究結(jié)果進一步表明，鞣花酸同時具有抑制PDGFB的表達，抑制JAK/ STAT信號途徑中STAT3的磷酸化從而發(fā)揮抗血管生成的作用。鞣花酸的抗血管生成作用與其同時抑制VEGF、PDGFB及其受體，并進一步抑制下游Ras-MARK、JAK/STAT信號途徑有關，其抗血管生成作用具有多靶點、多途徑的特點 （見圖5）。本研究結(jié)果進一步闡明了鞣花酸的抗血管生成機制，為鞣花酸后續(xù)研究與開發(fā)奠定基礎。

圖5 鞣花酸抗血管生成機理圖Fig.5 Mechanism of ellagic acid on angioenesis

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Ellagic acid inhibits the angiogenesis of HUVEC in vitro

YU Ya1， PAN Jia2， WU Jian-ming3， LILi-min2， LIXiang1， ZOUWen-jun1， QIN Xu-hua1*
（1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China；2.Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China；3.Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China）

AIMTo observe the anti-angiogenesis effect of ellagic acid in vitro on human umbilical vein endothelial cell（HUVEC）and to investigate the influence of ellagic acid on PDGFB，JAK/STAT signal pathway.METHODSThe effect of ellagic acid on the proliferation，migration and tube formation of HUVEC were studied using SRB assay，wound healing assays，and the tube formation，respectively.RT-PCR and ELISA assays were used to investigate the effects of ellagic acid on the expression of PDGFBmRNA and the secretion of PDGFB in the supernatant.The expression of PDGFB，STAT3 and p-STAT3 were studied using Western blot analysis.RESULTSEllagic acid inhibited the proliferation，migration and tube formation of HUVEC significantly（P＜0.01 or P＜0.05），the proliferation presented in a dose-dependent and time-dependentmanner and migration and tube formation of HUVEC in a time-dependentmanner，respectively.Meanwhile，ellagic acid down-regulated the gene and protein expression of PDGFB（P＜0.01 or P＜0.05）and inhibited the phosphorylation of STAT3（P＜0.01 or P＜0.05）in HUVECwhile had no influence on total STAT3 protein expression.CONCLUSIONEllagic acid can effectively inhibit the angiogenesis of HUVEC in vitro，which may be related to decreasing expression and secretion of PDGFB and phosphorylation of STAT3 in vascular endothelial cells.

ellagic acid；HUVEC；angiogenesis；PDGFB；STAT3

R966

：A

：1001-1528（2015）06-1181-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.006

2014-10-16

四川省科技廳項目 （2012JY0037）

于 婭（1990—），女，碩士，從事中藥臨床與應用研究。Tel：13730834400，E-mail：yuyaangela@163.com

*通信作者：秦旭華 （1972—），女，博士，副教授，從事中藥臨床理論及應用研究。Tel：13398199519，E-mail：qxhjsr@120.com