肖吉元， 劉海鵬， 白銀亮*， 楊興纓

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，甘肅蘭州730030；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院普外三科，甘肅蘭州730030）

燈盞花素對1-甲基-4-苯基吡啶誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞周期阻滯的影響

肖吉元1， 劉海鵬2， 白銀亮1*， 楊興纓1

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，甘肅蘭州730030；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院普外三科，甘肅蘭州730030）

目的考察燈盞花素對1-甲基-4-苯基吡啶 （MPP+）誘導(dǎo)的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C-12細(xì)胞周期阻滯的影響并探討其機(jī)制。方法MTT法檢測PC-12細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，Western blot技術(shù)檢測ERK1/2磷酸化水平。結(jié)果燈盞花素預(yù)處理明顯抑制MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞周期G2/M期阻滯，升高細(xì)胞存活率，增加ERK1/2磷酸化水平。ERK1/2抑制劑U0126預(yù)處理后，燈盞花素對細(xì)胞存活率和ERK1/2磷酸化水平無明顯作用。結(jié)論燈盞花素的作用機(jī)制與增加ERK1/2磷酸化水平有關(guān)。

燈盞花素；1-甲基-4-苯基吡啶 （MPP+）；PC-12細(xì)胞；周期阻滯；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）

帕金森病是老年人群中常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)，因此減少神經(jīng)元的凋亡對治療帕金森病至關(guān)重要［1-2］。細(xì)胞凋亡的發(fā)生由多種途徑引起，其中細(xì)胞周期阻滯是誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的一個(gè)重要原因［3］。作者前期研究結(jié)果顯示，燈盞花素預(yù)處理可有效抑制1-甲基-4-苯基吡啶（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+）誘導(dǎo)的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C-12細(xì)胞調(diào)亡的發(fā)生［4］，但其對MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞周期阻滯的影響尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)將在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察燈盞花素對MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞周期阻滯的影響及機(jī)制，以更深入地闡明燈盞花素對MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與儀器

燈盞花素注射液 （10 mg/支，批號20120207-2，昆明龍津制藥有限公司）；DMEM培養(yǎng)基 （美國Gibco公司）；1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）、ERK特異性抑制劑 U0126、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、碘化丙啶 （PI）、核糖核酸酶 （Rnase）（美國 Sigma公司）；Phospho-p44/42 MAPK（ERK1/2），β-actin抗體（美國Santa Cruz公司）；Complete蛋白酶抑制劑、PhosSTOP磷酸酶抑制劑（Roche公司）。大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株（PC-12細(xì)胞）由中科院上海細(xì)胞庫提供。Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific公司）；Accuri C6流式細(xì)胞儀 （美國BD公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 參考前期研究方法［4］培養(yǎng)PC-12細(xì)胞，所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞對數(shù)生長期進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分空白對照組、模型組和燈盞花素組（12.5、25、50μg/L），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，所有試驗(yàn)均重復(fù)4次。各組分別如下處理：模型組，250 μmol/LMPP+處理細(xì)胞，建立帕金森病（PD）細(xì)胞模型；燈盞花素組，不同質(zhì)量濃度燈盞花素分別預(yù)處理細(xì)胞24 h后再加入250μmol/L MPP+；空白對照組則只加等體積培養(yǎng)基。

2.2 細(xì)胞存活率檢測 將細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，按 “2.1”項(xiàng)所述方法進(jìn)行藥物處理，待藥物作用24 h后加入20μL 5 mg/mLMTT溶液，作用4 h后棄上清，每孔加入二甲基亞砜100μL，振蕩后用酶標(biāo)儀測量波長570 nm處各孔的吸光度值并計(jì)算相對細(xì)胞存活率值。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 按 “2.2”項(xiàng)所述方法處理細(xì)胞，待藥物孵育24 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS制成細(xì)胞懸液，加入冷的無水乙醇，4℃固定過夜。離心除去固定液并用PBS洗滌2遍，配制含1%Triton X-100的PBS溶液，加入RNA酶和PI染色液，室溫避光孵育30 min，染色后吹打均勻，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行周期檢測。

2.4 Western blot檢測ERK1/2磷酸化水平

2.4.1 燈盞花素對MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞ERK磷酸化水平的影響 按 “2.2”項(xiàng)所述方法處理細(xì)胞，待藥物孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，后加入適量RIPA細(xì)胞裂解液（含4%蛋白酶抑制劑和10%磷酸酶抑制劑）冰上震搖裂解 30 min，離心（12 000 r/min，4℃）15 min，取上清。BCA法對樣品中總蛋白進(jìn)行定量，規(guī)定上樣量為40μg。p-ERK1/2抗體和ERK1/2抗體均按1∶1 000稀釋，β-actin抗體稀釋濃度為1∶3000。

2.4.2 U0126對MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞ERK磷酸化水平的影響 將細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組、U0126組、U0126+MPP+組和燈盞花素組，各組處理如下：U0126組，1μmol/L U0126預(yù)處理48 h；U0126+MPP+組，1μmol/L U0126預(yù)處理24 h后加入250μmol/L的MPP+處理24 h；燈盞花素組，1μmol/L U0126預(yù)處理10 min后加入50μg/L燈盞花素預(yù)處理細(xì)胞24 h，加入250μmol/L的MPP+處理24 h，空白對照組則只加等體積培養(yǎng)基處理48 h。棄去培養(yǎng)液，按 “2.4.1”項(xiàng)所述方法檢測各組的ERK1/2磷酸化水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD組間多重比較，P＜0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 燈盞花素對MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞存活率的影響 圖1可見，模型組細(xì)胞相對存活率為（43.3±8.1）%，與空白對照組比較，模型組細(xì)胞存活率明顯下降 （P＜0.001）。燈盞花素預(yù)處理能有效抑制MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞存活率降低（P＜0.001）。該結(jié)果與前期研究結(jié)果［4］一致。

圖1 燈盞花素對MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞存活率下降的影響(x±s,n=4)Fig.1 Effect of scutellarin on decreased cell viability in MPP+-induced PC-12 cells(x±s,n=4)

3.2 燈盞花素對MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞周期的影響 如表1所示，MPP+作用后，G2/M細(xì)胞比例為 （12.5±1.4）%，與空白對照組相比呈顯著性增加 （P＜0.001）。燈盞花素預(yù)處理能夠抑制MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞G2/M期增加（P＜0.01）。

表1 燈盞花素對M PP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞周期的影響(x±s,n=4)Tab.1 E ffect of scutellarin on the PC-12 cell cycle induced by M PP+(x±s,n=4)

3.3 燈盞花素對MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平的影響 如圖2所示，與空白對照組相比，模型組ERK1/2磷酸化水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。與模型組比較，燈盞花素預(yù)處理能夠升高ERK1/2磷酸化水平（P＜0.05）（圖2A）。各組之間總ERK1/2水平?jīng)]有明顯差異 （圖2B）。

圖2 燈盞花素對MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞ERK 1/2磷酸化水平的影響 (x±s,n=4)Fig.2 Effect of scutellarin on phosphorylated ERK1/2 level of PC-12 cells induced by MPP+(x±s,n=4)

3.4 U0126逆轉(zhuǎn)燈盞花素對MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 如圖3所示，ERK抑制劑U0126單獨(dú)預(yù)處理正常細(xì)胞后，細(xì)胞存活率顯著下降（P＜0.01），U0126和MPP+共處理細(xì)胞后，細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降 （P＜0.001），與U0126組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），U0126+燈盞花素+MPP+共處理細(xì)胞后，細(xì)胞存活率有所上升，但與U0126組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與50μg/L燈盞花素+MPP+組（圖1）相比，細(xì)胞存活率明顯降低 （P＜0.05），可見U0126可逆轉(zhuǎn)燈盞花素對MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用（圖3A）。Western blot結(jié)果顯示，U0126預(yù)處理后，細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平明顯降低。U0126和MPP+共處理細(xì)胞后，細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平進(jìn)一步降低 （P＜0.01），U0126+燈盞花素+MPP+共處理細(xì)胞后，細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平有所上升，與U0126組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與50μg/L燈盞花素+MPP+組相比，ERK1/2磷酸化水平明顯降低（P＜0.05）（圖3B）。

圖3 U0126逆轉(zhuǎn)燈盞花素對M PP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 (x±s,n=4)Fig.3 U0 126 reversed the protectiveeffect of scutellarin on MPP+-induced injury in PC-12 cells(x±s,n=4)

4 討論

MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷模型是目前研究帕金森病的最常用的體外細(xì)胞模型［5］。大量研究顯示，MPP+可誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞周期G2/M阻滯和凋亡的發(fā)生［6-7］，課題組前期研究成果共同證實(shí)了這一點(diǎn)。眾所周知，細(xì)胞的增殖周期和凋亡是相互伴隨的過程，而且是在細(xì)胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)調(diào)控和細(xì)胞外信號共同影響下有序進(jìn)行的［8-9］。在細(xì)胞周期中各個(gè)時(shí)相 （G0期、G1期、S期、G2期和M期）間存在有影響細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控點(diǎn)，藥物干預(yù)往往能夠激活調(diào)控點(diǎn)調(diào)節(jié)機(jī)制，從而影響細(xì)胞周期的進(jìn)行［9］。眾多研究表明，帕金森病的發(fā)生與神經(jīng)元增殖周期的改變密切相關(guān)，而且認(rèn)為細(xì)胞周期的異常正是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的主要原因［10-11］。因此，針對神經(jīng)元增殖周期異常的干預(yù)措施已成為治療帕金森病的新的研究方向［11-12］。

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellar signal-regulated kinase，ERK）作為絲裂原活化蛋白激酶（motigen-activated protein kinase，MAPK）家族中的重要成員，與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等密切相關(guān)［13-14］。普遍認(rèn)為，ERK是將胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核的關(guān)鍵，它能通過作用于E1k-1、cmyc、c-fos等轉(zhuǎn)錄因子影響細(xì)胞的增殖與分化，而且很多藥物能通過抑制ERK的活化引起細(xì)胞周期阻滯［15-17］?？梢姡珽RK的活化 （磷酸化）對細(xì)胞增殖周期的順利進(jìn)行至關(guān)重要［18］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，燈盞花素能夠抑制MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞周期G2/M阻滯并有效提高細(xì)胞存活率。Western blot結(jié)果顯示，燈盞花素能夠增加ERK1/2磷酸化水平，而且這種作用與其提高細(xì)胞存活率呈對應(yīng)關(guān)系；當(dāng)ERK1/2抑制劑U0126預(yù)處理后，燈盞花素對細(xì)胞存活率的并無明顯升高作用?？梢姡珽RK1/2的活化在燈盞花素提高細(xì)胞存活率作用中扮演重要角色。結(jié)合細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為燈盞花素通過增加ERK1/2磷酸化水平，從而抑制MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞周期G2/ M阻滯，并最終提高細(xì)胞存活率。

總之，本實(shí)驗(yàn)及前期研究成果共同表明燈盞花素能夠通過抑制MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞周期G2/ M阻滯和凋亡，從而有效提高細(xì)胞存活率，發(fā)揮對MPP+誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，該研究將為帕金森病的臨床治療提供一新的治療思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of scutellarin on 1-m ethyl-4-phenylpyridinium-induced PC-12 cell cycle arrest

XIAO Ji-yuan1， LIU Hai-peng2， BAIYin-liang1*， YANG Xing-ying1
（1.Department of Pharmacy，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030，China；2.The3rd Department of General Surgery，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030，China）

AIMTo investigate the effect of scutellarin on 1-methyl-4-phenylpyridinium（MPP+）-induced cell cycle arrest in pheochromocytoma cell line PC-12 and its relevantmechanism.METHODSCell viability was analyzed with MTT assay.Cell cycle wasmeasured by flow cytometry.The expression of phosphorylated ERK1/2 was analyzed by Western blot.RESULTSPretreatment with scutellarin significantly inhibited PC-12 cell cycle G2/M phase arrest induced by MPP+.It alsomarkedly increased the cell viability and the phosphorylated ERK1/2 level.These effects were abolished by ERK1/2 specific inhibitor U0126.CONCLUTIONScutellarin'smechanism of actionmay be correlated to the increase of phosphorylated ERK1/2.

scutellarin；1-methyl-4-phenylpyridinium（MPP+）；pheochromocytoma cell line PC-12；cell cycle arrest；extracellular regulated protein kinases1/2（ERK1/2）

R966

：A

：1001-1528（2015）07-1407-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.004

2014-07-08

甘肅省科技計(jì)劃自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （145RJZA143）

肖吉元（1972—），男，副主任中藥師，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。E-mail：lzuxjy@163.com

*通信作者：白銀亮，男，醫(yī)學(xué)碩士，講師，研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)。Tel：（0931）8942491，E-mail：lzubyl@163.com