陳祝華 袁科宇 錢(qián)光煜 朱鐵明

膽囊癌中PTEN基因異常表達(dá)及甲基化的研究

陳祝華 袁科宇 錢(qián)光煜 朱鐵明

目的 探討膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移與PTEN基因異常表達(dá)及其基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化的關(guān)系。方法 選取膽囊癌標(biāo)本44例（膽囊癌組）和膽囊炎標(biāo)本20例（對(duì)照組），通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、Western-blot、甲基化特異性PCR法分析兩組患者膽囊組織中PTEN基因表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化差異。結(jié)果 與對(duì)照組相比，膽囊癌組中PTEN基因表達(dá)陽(yáng)性率明顯下降（P＜0.01），而啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率顯著增高（P＜0.01）；膽囊癌組中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者PTEN基因表達(dá)陽(yáng)性率較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者降低（P＜0.05），而啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率增高（P＜0.05）；膽囊癌分期增高，PTEN基因表達(dá)陽(yáng)性率降低（P＜0.05），而啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率增高（P＜0.05）。結(jié)論 PTEN基因低表達(dá)是膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的重要原因之一，其低表達(dá)與啟動(dòng)子區(qū)過(guò)度甲基化有關(guān)。

膽囊癌 PTEN基因 甲基化

原發(fā)性膽囊癌是膽道系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，我國(guó)原發(fā)性膽囊癌在消化道腫瘤中居第5位，居膽道腫瘤首位。近年調(diào)查顯示，我國(guó)大部分地區(qū)膽囊癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。膽囊癌的確切病因不明，發(fā)病隱匿，早期診斷困難,惡性程度高,發(fā)展快,手術(shù)切除率低，預(yù)后極差，患者的5年生存率低于5%。要提高原發(fā)性膽囊癌患者的遠(yuǎn)期生存率和生活質(zhì)量，除了應(yīng)在提高診斷率、規(guī)范手術(shù)治療及術(shù)后放射、化學(xué)治療方式上面不斷改進(jìn)外，還應(yīng)在分子水平上進(jìn)一步明確膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展和演變。PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路雖然在其他惡性腫瘤的研究中已有很多的報(bào)道，但其對(duì)膽囊癌發(fā)生、發(fā)展的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常的機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)染色、Western-blot及甲基化特異性PCR法檢測(cè)膽囊癌組織PTEN基因的表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況，探討PTEN蛋白下調(diào)的遺傳分子生物學(xué)機(jī)制及其與膽囊癌生物學(xué)行為的關(guān)系和臨床意義。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本 隨機(jī)選取2009年1月至2014年12月我院病理檢查證實(shí)為膽囊癌的標(biāo)本44例，患者年齡50～78（68±7.21）歲；其中男20例，女24例；Nevin分期Ⅰ期2例，Ⅱ期2例，Ⅲ期5例，Ⅳ期10例，Ⅴ期25例。每例標(biāo)本（1cm×1cm×1cm）取一半經(jīng)10%多聚甲醛固定后常規(guī)病理切片，厚5μm，另一半置于-80℃冰箱作Western-blot及甲基化特異性PCR。另隨機(jī)選取同期20例膽囊炎標(biāo)本為對(duì)照組。兩組患者性別、年齡等一般情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 濃縮型兔抗人PTEN蛋白多克隆抗體（美國(guó)Abicam公司），SP免疫組化檢測(cè)試劑（溫州長(zhǎng)風(fēng)生物技術(shù)有限公司），強(qiáng)SDS裂解液、顯影定影試劑盒、蛋白酶抑制劑（江蘇碧云天生物技術(shù)公司），蛋白定量試劑盒（美國(guó)普利萊基因技術(shù)有限公司），基因組DNA提取試劑盒（中國(guó)IANGEN BIOTECH公司），總DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒（美國(guó)ZYMO RESEARCH公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 采用SP法檢測(cè)相應(yīng)抗體抗原。用已知陽(yáng)性的乳腺癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，按其占同類(lèi)計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比計(jì)算PTEN蛋白染色結(jié)果。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，以確定每個(gè)視野的陽(yáng)性率，取其平均值作為該例的陽(yáng)性率。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞比例＜10%為染色陰性，10%～30%為弱陽(yáng)性，31%～70%為中度陽(yáng)性，＞70%為強(qiáng)陽(yáng)性；弱陽(yáng)性、中度陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性例數(shù)之和作為總陽(yáng)性數(shù)。

1.3.2 Western-blot混勻每例膽囊癌標(biāo)本，同理取對(duì)照組混合標(biāo)本。用強(qiáng)SDS裂解液裂解，其中按體積比1∶100加入蛋白酶抑制劑，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每組取100μg蛋白，在12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離細(xì)胞總蛋白，目的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h。多克隆兔抗人PTEN抗體孵育4℃過(guò)夜（1∶1 200），再用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記鼠抗兔IgG（1∶1 200），孵育室溫1.5h，最后用TBST緩沖液洗膜10min 3次，用顯影試劑盒顯影。Gelpro32軟件測(cè)定條帶積分光密度（IOD）值，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶的IOD值之比分別作為PTEN基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 甲基化特異性PCR 基因組DNA提取試劑盒提取膽囊癌及對(duì)照組DNA，紫外分光光度計(jì)（日本日立公司）測(cè)定總DNA含量和純度（1.8＜A260/A280＜2.0），瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因完整性?？侱NA亞硫酸氫鹽修飾采用EZ DNA Methylation-Gold KitTM，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。甲基化特異性PCR法擴(kuò)增PTEN基因，引物設(shè)計(jì)參照PTEN基因序列（Genbank accession number AF067844）合成。PTEN基因甲基化引物上游序列：5′-GGCGGCGGTCGCGGTTC-3′；下游序列：5′-GACTCCCCGAAAACGCTAC-3′；非甲基化引物上游序列：5′-GTGTTGGTGGAGGTAGTTGTTT-3；下游序列：5′-ACCACTTAACTCTAAACCACAACCA-3′。PCR反應(yīng)體系條件：94℃3min預(yù)變性后開(kāi)始30個(gè)循環(huán)，94℃30s，64（58）℃1min，72℃45s，最后于72℃延伸7min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.6%瓊脂糖凝膠電泳，電壓80V，時(shí)間40min，后再用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶。甲基化引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為71bp；非甲基化引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為162bp。結(jié)果判定：甲基化引物擴(kuò)增陽(yáng)性者計(jì)入陽(yáng)性病例；非甲基化引物擴(kuò)增陽(yáng)性，且甲基化引物擴(kuò)增陰性者計(jì)入陰性病例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PTEN基因表達(dá)情況 SP法檢測(cè)兩組標(biāo)本可見(jiàn)PTEN蛋白主要定位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，表現(xiàn)為棕色顆粒，見(jiàn)圖1。通過(guò)Western-blot可以看出PTEN蛋白條帶約為50kD，內(nèi)參條帶為36kD，見(jiàn)圖2。膽囊癌組PTEN基因表達(dá)陽(yáng)性率較對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見(jiàn)表1。

圖1 PTEN基因表達(dá)（A：膽囊癌組；B：對(duì)照組；SP法染色，×400）

表1 PTEN基因表達(dá)情況[例（%）]

2.2 PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況 通過(guò)甲基化特異性PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，甲基化引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為71bp，非甲基化引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為162bp，見(jiàn)圖3。膽囊癌組中PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），詳見(jiàn)表2。

2.3 膽囊癌組不同臨床病理參數(shù)與PTEN基因表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況的關(guān)系 不同性別、年齡的膽囊癌患者PTEN基因表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）；膽囊癌組中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者PTEN基因表達(dá)陽(yáng)性率較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者降低（P＜0.05），而啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率增高（P＜0.05）；膽囊癌分期增高，PTEN基因表達(dá)陽(yáng)性率降低（P＜0.05），而啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率增高（P＜0.05）；詳見(jiàn)表3。

圖2 PTEN蛋白Western-blot圖（A：對(duì)照組；B：膽囊癌組）

圖3 PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況（A：DNA內(nèi)參；B、C條帶：膽囊癌組基因，分別由非甲基化和甲基化引物擴(kuò)增；D、E條帶：對(duì)照組基因，分別由非甲基化和甲基化引物擴(kuò)增；F、G條帶：甲基化陰性和陽(yáng)性對(duì)照。）

表2 PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況[例（%）]

表3 膽囊癌組不同臨床病理參數(shù)與PTEN基因表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況的關(guān)系[例（%）]

3 討論

許多疾病的致病機(jī)制中一般有多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)紊亂的參與，往往是由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)失衡引起[2]。近十幾年來(lái)，盡管單一線性炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已得到很好的研究，但單一細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能解釋細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。因此，國(guó)內(nèi)外細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究已由單個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，向復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)及與表觀遺傳相結(jié)合的趨勢(shì)研究發(fā)展[3]。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及到多種原癌基因的活化、抑癌基因的失活或突變、細(xì)胞周期紊亂等多種生物學(xué)改變，膽囊癌也不例外。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究已證明DNA異常甲基化是抑癌基因失活的重要機(jī)制，甚至在某些情況下是抑癌基因失活的唯一機(jī)制[4]。

PTEN基因定位于10q23.3，其產(chǎn)物PTEN蛋白具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶活性，能使某些磷脂或蛋白激酶相應(yīng)位點(diǎn)去磷酸化，抑制細(xì)胞周期的運(yùn)行，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并調(diào)控細(xì)胞的黏附、遷移和分化，是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)有磷酸酶活性的抑癌基因。研究顯示，PTEN蛋白參與多種細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，形成復(fù)雜的細(xì)胞間信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，目前研究較多的有以下幾個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：PI3K/Akt途徑、MAPK/ERK途徑、FAK途徑，其中PI3K/Akt途徑是目前研究最多且與抑癌作用最密切一條通路[5-6]。

PTEN基因失表達(dá)在人甲狀腺癌、大腸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、星形細(xì)胞瘤、卵巢癌、胃癌、甲狀腺癌等腫瘤中均有報(bào)道。而PTEN基因在膽囊癌中研究較少，其表達(dá)陽(yáng)性率與腫瘤分期的關(guān)系以及表觀遺傳分子機(jī)制不明。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組中PTEN表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于膽囊癌組，提示PTEN基因表達(dá)下降與膽囊癌的發(fā)生密切相關(guān),與Zheng等[7]報(bào)道相符。膽囊癌組中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者PTEN基因表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，分期愈高，PTEN基因表達(dá)陽(yáng)性率越低。本研究還以Western－blot方法從蛋白半定量水平上證實(shí)PTEN蛋白在膽囊癌中低水平，這為PTEN基因在膽囊癌中的表達(dá)情況提供了進(jìn)一步的證據(jù)。

PI3K/Akt是重要的細(xì)胞信號(hào)通路，能夠激活生存信號(hào)，使細(xì)胞表現(xiàn)為不死性，且能控制正常血管發(fā)展和腫瘤血管生成。研究表明，大多腫瘤與此通路過(guò)度活化有關(guān)。而PTEN蛋白的磷酸酶能使PIP3脫磷酸并使PIP2向PIP3的轉(zhuǎn)化發(fā)生逆轉(zhuǎn)，從而拮抗PI3K/Akt通路。膽囊癌組織中PTEN蛋白下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞PI3K/Akt通路過(guò)度活化，特異性誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制因子p21、p27和p57生成作用減弱，cyclinD1的總水平和核定位增加，細(xì)胞周期過(guò)快從G1期進(jìn)入S期，細(xì)胞增殖加速；膽囊癌組織中PTEN基因表達(dá)下調(diào)也使得前凋亡分子例如Fas和bim的活化下調(diào)，進(jìn)而使抗凋亡分子如bcl-2家族成員Bad與性連鎖的凋亡抑制子活化，細(xì)胞凋亡受阻、細(xì)胞過(guò)度增殖，最終導(dǎo)致癌變。膽囊癌轉(zhuǎn)移途徑中以淋巴途徑轉(zhuǎn)移為最多見(jiàn)，局灶黏附激酶能介導(dǎo)細(xì)胞持續(xù)性遷移，而PTEN蛋白降低能使得其去磷酸化局灶黏附激酶的作用減弱，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞黏附、鋪展和遷移。此外PTEN基因失表達(dá)還能介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)錄，與血流途徑轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。

研究證實(shí)，PTEN基因低表達(dá)的原因主要包括PTEN基因突變、缺失和5′CpG島異常甲基化。本研究通過(guò)對(duì)PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化研究，進(jìn)一步分析PTEN基因表達(dá)陽(yáng)性率下降的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。有學(xué)者在甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌中已經(jīng)證實(shí)PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)存在過(guò)度甲基化現(xiàn)象。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤（CpG）二核苷酸的胞嘧啶中5位碳原子上。過(guò)度甲基化，尤其是基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化將直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合，從而使基因不能轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄水平降低。PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)5′CpG島過(guò)度甲基化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制，進(jìn)而導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)物PTEN蛋白的減少甚至缺失。

綜上所述，膽囊癌中PTEN基因由于其啟動(dòng)子區(qū)過(guò)度甲基化，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄、表達(dá)下調(diào)，促使PTEN蛋白在膽囊癌形成過(guò)程中抑制細(xì)胞增殖、促使凋亡的作用減弱，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展[9]。PTEN基因作為一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，在膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展中有重要的作用，加之膽囊癌起病隱匿，早期診斷困難，PTEN基因可以作為輔助判斷疾病的潛在標(biāo)志物或膽囊癌預(yù)后的重要指標(biāo)[10]。

[1]Rakic M,PatrljL,Kopljar M,et al.Gallbladder cancer[J].Hepatobiliary Surg Nutr,2014,3(5):221-226.

[2]Gao J,LiWX,Feng S Q,et al.Aprotein-protein interaction network of transcription factors acting during liver cell proliferation[J].Genomics,2008,91(4):347-355.

[3]Osipo C,Golde T E,Osborne B A,et al.Off the beaten pathway: the complex cross talk between Notch and NF-kappaB[J].Lab Invest,2008,88(1):11-17.

[4]Jones P A,TakaiD.The role of DNA methylation in mammalion epigenetics[J].Science,2001,293(5532):1068-1070.

[5]Guigon C J,Zhao L,Willingham M C,et al.PTEN deficiency accelerates tumour progression in a mouse model of thyroid cancer [J].Oncogene,2009,28:509-517.

[6]Peng Hou,Dingxie Liu,Yuan Shan,et al.Genetic Alterations and Their Relationship in the Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt Pathway in Thyroid Cancer[J].Clin Cancer Res,2007,13(4):1161-1170.

[7]Zheng C L,Wen J F,Huang Y.Expression and significance of PTEN and nm23 in the metastasis of gallbladder cancer[J].Zhong Nan Da Xue Xue Bao YiXue Ban,2005,30(1):46-48.

[8]Hamada K,Sasaki T,Koni P A,et al.The PTEN/PI3K pathway governs normal vascular development and tumor angiogenesis [J].Genes Dev,2005,19(17):2054-2065.

[9]Liu D C,Yang Z L.Overexpression ofEZH2 and loss ofexpression of PTEN is associated with invasion,metastasis,and poor progression of gallbladder adenocarcinoma[J].Pathology,research and practice,2011,207(8):472-478.

[10]Chang H J,Yoo B C,Kim S W,et al.Significance of PMLand p53 protein as molecular prognostic markers of gallbladder carcinomas[J].Pathol Oncol Res,2007,13(4):326-335.

Abnormal expression and promoter methylation of PTEN gene in cholecystic carcinoma

CHEN Zhuhua,YUAN Keyu,QIAN Guangyu, et al.
Department of General Surgery，Zhuji People's Hospital，Zhuji 311800,China

Objective To investigate the expression and promoter methylation of PTEN gene in cholecystic carcinoma. Methods Forty four tissue samples of cholecystic carcinoma(cancer group)and 20 samples of cholecystitis(control group)were collected.The expression of PTEN protein was detected by immunohistochemistry and Western-blotting,and the methylation of PTEN promoter was determined by methylation-specific PCR in tissue specimens of both groups. Results Compared with control group，the PTEN protein expression was significantly lower(P＜0.01)in cholecystic carcinoma tissue,while the promoter methylation of PTEN gene was more frequent(P＜0.01).PTEN expression rate in cholecystic cancer with lymph node metastasis was lower than those without lymph node metastasis(P＜0.05),while the promoter methylation rate was increased(P＜0.05).The staging of cholecystic cancer was negatively correlated with PTEN expression(P＜0.05),while was positively correlated with promoter methylation rate(P＜0.05). Conclusion Promoter hypermethylation may be related to the down-regulation of PTEN gene in cholecystic carcinoma,which may result in the metastasis of the cancer.

Cholecystic carcinoma PTEN Methylation

2014-12-25）

（本文編輯：李媚）

諸暨市科技計(jì)劃一般科研項(xiàng)目（2013AA14297）

311800 諸暨市人民醫(yī)院普外科

朱鐵明，E-mail：doctm@163.com