王 雪 李連坤 張彥飛 貢濟(jì)宇 蔡廣知 趙躍剛

吉林省長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130117

細(xì)辛為馬兜鈴科植物北細(xì)辛Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. maudshuricum（Maxim.）Kitag.、漢城細(xì)辛A. sieboldii Miq. var. seouleuse Na-kai 或華細(xì)辛A.sieboldii Miq.的干燥根及根莖[1]。 細(xì)辛性溫味辛，具有祛風(fēng)止痛、解表散寒、通竅、溫肺化飲的功效，主要用于治療風(fēng)寒感冒、頭痛、風(fēng)濕痹痛、痰飲喘咳[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明細(xì)辛具有抗炎鎮(zhèn)痛作用[3]，臨床上常用于治療頭痛、坐骨神經(jīng)痛、牙痛和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病[4]。 現(xiàn)代研究表明馬兜鈴科植物大多含有馬兜鈴酸[5]。 馬兜鈴酸對(duì)人體有腎毒作用，因此，降低細(xì)辛中馬兜鈴酸的含量并保證其藥效已成為現(xiàn)代中藥研究的重點(diǎn)內(nèi)容，藥材炮制對(duì)細(xì)辛的藥效有無(wú)影響也是研究的重點(diǎn)內(nèi)容。 本實(shí)驗(yàn)就以上問(wèn)題進(jìn)行相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR 小鼠，SP 級(jí)，雌雄各半，平均體重為（20±2）g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供， 許可證號(hào)：SCXK11-00-0009。 動(dòng)物均飼養(yǎng)于溫度（22±1）℃，相對(duì)濕度（60±5）%的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，人工光照，12 h 明暗周期，給予標(biāo)準(zhǔn)小鼠鼠糧飼養(yǎng)。

1.2 試藥與制備

選取吉林省的北細(xì)辛，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥物分析實(shí)驗(yàn)室人員（蔡廣知，中級(jí)）鑒定后，細(xì)辛品質(zhì)優(yōu)良，屬馬兜鈴科植物北細(xì)辛。

藥物制備：生品和炮制品（采用碳酸氫鈉堿制后的炮制品）均以8 倍量水浸泡30 min，煎煮至沸騰后再持續(xù)加熱30 min，將水煎液倒出，藥渣繼續(xù)以6 倍量水煎煮，方法同上[6]。合并2 次提取液后并濃縮至每毫升含生藥21.3 g，得到兩者的水煎液。

1.3 試劑

0.9%氯化鈉注射液（生理鹽水，浙江美森進(jìn)出口有限公司，批號(hào)：639003），阿司匹林腸溶片（貴州同濟(jì)堂制藥有限公司，批號(hào)：080411），醋酸（北京化工廠，批號(hào)：20071015），二甲苯（北京化工廠，批號(hào)：20061209）。

1.4 儀器

YLS26 B 智能熱板儀，YLS2 Q4 耳腫打孔器（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站），AB135-S 電子天平（梅特勒-托利多公司）。

1.5 方法

1.5.1 醋酸扭體實(shí)驗(yàn) 取ICR 小鼠，按雌雄各半，將小鼠隨機(jī)分為6 組，每組10 只。生理鹽水組（20 mL/kg），阿司匹林組（0.02 g/kg），細(xì)辛生品和炮制品的水煎液高、低劑量組（生藥量3.0、0.5 g/kg），預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示增加劑量并不能顯著提高細(xì)辛抗炎鎮(zhèn)痛作用，因此選擇3.0 g/kg 為高劑量組。 實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食12 h，各組小鼠采取灌胃給藥，一次性給予生理鹽水、阿司匹林、細(xì)辛生品水煎液、細(xì)辛炮制品水煎液[7-9]，給藥2 h 后腹腔注射0.6%醋酸0.2 mL。 記錄小鼠初次出現(xiàn)醋酸樣疼痛反應(yīng)時(shí)間（疼痛潛伏期）以及10 min 內(nèi)的扭體次數(shù)作為疼痛反應(yīng)的指標(biāo)。

1.5.2 熱板實(shí)驗(yàn) 調(diào)節(jié)熱板溫度至55℃， 以小鼠舔后足、跳躍反應(yīng)為觀察指標(biāo)，記錄小鼠自放入熱板儀到初次出現(xiàn)舔后足的時(shí)間，以此作為小鼠的痛閾值[6]。選擇痛閾值在6～60 s 范圍內(nèi)的小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用。 將小鼠按痛閾值分別分到上述各組，給藥方案及給藥劑量同“1.5.1”，各組于給藥后1、2 h 記錄小鼠的足腫脹度。

1.5.3 二甲苯致耳廓腫脹實(shí)驗(yàn) 選取實(shí)驗(yàn)用ICR 小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分組，每組10 只。分組情況、給藥方法和給藥劑量同“1.5.1”。 各組動(dòng)物于給藥40 min 后，在小鼠右耳廓內(nèi)外各涂30 μL 二甲苯致炎， 于給藥后15 min 處死小鼠并剪下雙耳，用直徑6 mm 的打孔器打下左右等大的耳片稱重。 記錄稱重?cái)?shù)據(jù)，左耳重量作自身對(duì)照， 以左右耳片重量之差作為炎癥的腫脹度。耳廓腫脹度（mg）=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量。炎癥抑制率=（生理鹽水組耳廓腫脹度-用藥組耳廓腫脹度）/生理鹽水組耳廓腫脹度×100%。

1.5.4 急性毒性實(shí)驗(yàn) 選取實(shí)驗(yàn)用小鼠，于實(shí)驗(yàn)前14 h禁食，不禁水，隨機(jī)分為正常組和對(duì)照組，細(xì)辛生品水煎 液84.34、112.50、150.13、200.40、267.20 g/（kg·d）（分 別 相 當(dāng) 于 臨 床 日 用 劑 量 的9.38、12.40、16.80、22.20、29.80 倍）5 個(gè)不同劑量組和細(xì)辛炮制品水煎液474.70、632.83、843.76、1125.10、1500.30 g/（kg·d）（分別 相 當(dāng) 于 臨 床 日 用 劑 量 的52.74、70.50、93.60、125.10、166.60 倍）5 個(gè)不同劑量組[10]，雌雄各半，每組10 只。 分別于每天上、下午分次灌胃給藥，間隔6 h，給藥40 mL/（kg·次），連續(xù)給藥7 d，觀察給藥后7 d內(nèi)小鼠的狀態(tài)、死亡情況以及死亡分布時(shí)間。 解剖死亡動(dòng)物，觀察內(nèi)部臟器變化[11]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 小鼠急性毒性LD50實(shí)驗(yàn)采用概率單位法計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)辛炮制前后水煎液對(duì)藥效學(xué)的影響

2.1.1 對(duì)小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)的影響 與生理鹽水組比較，其他5 組小鼠疼痛潛伏期均延長(zhǎng)，扭體次數(shù)均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。細(xì)辛生品水煎液高劑量組扭體次數(shù)多于炮制品水煎液高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 見(jiàn)表1。2.1.2 對(duì)小鼠熱板實(shí)驗(yàn)的影響 與生理鹽水組比較，其他5 組小鼠足腫脹度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。 細(xì)辛生品水煎液高劑量組給藥后1、2 h 足腫脹度高于細(xì)辛炮制品水煎液高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 見(jiàn)表2。

表1 細(xì)辛炮制前后水煎液對(duì)小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)的影響（±s，n = 10）

表1 細(xì)辛炮制前后水煎液對(duì)小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)的影響（±s，n = 10）

注：與生理鹽水組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與細(xì)辛生品水煎液高劑量組比較，△P ＜0.05

組別 疼痛潛伏期（s） 扭體次數(shù)（次）生理鹽水組阿司匹林組細(xì)辛生品水煎液低劑量組細(xì)辛生品水煎液高劑量組細(xì)辛炮制品水煎液低劑量組細(xì)辛炮制品水煎液高劑量組286.20±114.70 810.20±210.40**317.80±116.60*356.50±101.50*328.10±150.60*394.70±172.40*19.51±2.32 5.31±2.18**14.91±2.03*11.01±2.83*13.11±2.54*8.71±2.04**△

表2 細(xì)辛炮制前后水煎液對(duì)小鼠熱板實(shí)驗(yàn)的影響（mg，±s，n = 10）

表2 細(xì)辛炮制前后水煎液對(duì)小鼠熱板實(shí)驗(yàn)的影響（mg，±s，n = 10）

注：與生理鹽水組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與細(xì)辛生品水煎液高劑量組比較，△P ＜0.05

組別 給藥后1 h 足腫脹度 給藥后2 h 足腫脹度生理鹽水組阿司匹林組細(xì)辛生品水煎液低劑量組細(xì)辛生品水煎液高劑量組細(xì)辛炮制品水煎液低劑量組細(xì)辛炮制品水煎液高劑量組25.00±8.23 8.00±2.16**18.00±2.56*13.00±1.86**17.00±1.91*9.00±1.99**△28.00±5.86 9.00±1.77**19.00±1.80*14.00±2.30**18.00±1.79*10.00±2.30**△

2.1.3 對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)的影響 與生理鹽水組比較，其他5 組小鼠耳廓腫脹度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。 細(xì)辛生品水煎液低劑量組耳廓腫脹度高于細(xì)辛炮制品水煎液低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 細(xì)辛生品水煎液低劑量組炎癥抑制率低于細(xì)辛炮制品水煎液低劑量組（P＜0.05）。 見(jiàn)表3。

表3 細(xì)辛炮制前后水煎液對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)的影響（n=10）

2.2 對(duì)毒理學(xué)的影響

細(xì)辛生品水煎液的LD50為145.45 g/kg，其95%置信區(qū)間為128.50～166.75 g/kg；細(xì)辛炮制品水煎液的LD50為846.16 g/kg，其95%置信區(qū)間為707.19～1012.39 g/kg，細(xì)辛生品水提物的毒性是炮制品的5.82 倍， 提示細(xì)辛生品炮制后毒性顯著降低。給藥后第4 天小鼠集中死亡。解剖后，可觀察到小鼠的腎臟明顯腫大，并伴有白色，其他器官無(wú)明顯變化，腎毒性明顯。

3 討論

本文通過(guò)醋酸扭體實(shí)驗(yàn)、熱板實(shí)驗(yàn)以及二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)研究細(xì)辛炮制前后的藥效學(xué)，結(jié)果表明，炮制后的細(xì)辛可顯著提高小鼠的痛閾值[12-14]，鎮(zhèn)痛作用明顯增強(qiáng)；炮制后的細(xì)辛水煎液低劑量組炎癥抑制率為22.80%， 明顯高于生品水煎液低劑量組17.30%，抗炎作用顯著增強(qiáng)；細(xì)辛炮制前后的藥效學(xué)研究證明，生品經(jīng)堿制后，毒性明顯降低，且藥效增強(qiáng)。 這為臨床上規(guī)范炮制目的提供了示范。

小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，細(xì)辛生品的急性毒性顯著高于炮制品[15-16]，因此經(jīng)過(guò)堿制后的細(xì)辛毒性明顯降低，細(xì)辛主要對(duì)腎臟有急性毒性，腎衰竭是引發(fā)小鼠死亡的主要原因。本實(shí)驗(yàn)為臨床上細(xì)辛的安全用藥提供了依據(jù)。

現(xiàn)代藥理研究及臨床實(shí)踐均證明細(xì)辛有毒，隨著煎煮時(shí)間的延長(zhǎng)可使細(xì)辛中的揮發(fā)油揮發(fā)，細(xì)辛水煎液在臨床應(yīng)用中有安全性和有效性兩種特性， 因此，在臨床上應(yīng)用細(xì)辛入藥時(shí)， 應(yīng)在正確辨證的情況下，選擇合適的劑型，若服用的復(fù)方湯劑中含有大劑量細(xì)辛，應(yīng)盡量延長(zhǎng)煎煮時(shí)間達(dá)到減毒的目的，以確保用藥安全。

[1] 王根輩，曹晶，馬曉慧，等.淺談美國(guó)FDA 對(duì)植物藥制劑臨床前毒理研究的要求[J].中草藥，2013，44（1）：116-119.

[2] 譚玉柱，董婷婷，趙高瓊，等.基于“一測(cè)多評(píng)”法對(duì)大黃地上部位提取物的質(zhì)量控制研究[J].中草藥，2013，44（9）：1190-1194.

[3] 楊光成.麻黃附子細(xì)辛湯治療竇性心動(dòng)過(guò)緩60 例[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2013，20（1）：88-89.

[4] 覃桂革.中醫(yī)古方麻黃附子細(xì)辛湯加減合參麥注射液治療緩慢型心律失常臨床觀察[J].醫(yī)學(xué)信息，2013，26（4）：147.

[5] 周智恩.中西醫(yī)結(jié)合治療緩慢性心律失常的臨床研究[J].光明中醫(yī)，2013，28（7）：1414-1416.

[6] 耿乃志，才振國(guó)，杜春波，等.麻黃附子細(xì)辛湯加味治療頻發(fā)室早合并竇緩30 例[J].中醫(yī)藥信息，2012，29（6）：81-82.

[7] 魏文康，劉紅艷.麻黃附子細(xì)辛湯治療緩慢型心律失常30 例[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2012，32（24）：5533-5534.

[8] 苗靜琨，陳啟雄，李春，等.α-細(xì)辛醚抗癲癇作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2013，29（1）：38-41.

[9] 王曉麗，金禮吉，續(xù)繁星，等.中草藥細(xì)辛研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013，9（7）：68-71.

[10] 侯平，楊麗，劉寧，等.麻黃堿、β-細(xì)辛醚和去甲烏藥堿對(duì)大鼠心肌細(xì)胞鈣離子濃度和細(xì)胞膜鈣通道的影響[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，42（3）：201-203.

[11] 胡竟一，邱春燕，雷玲，等.細(xì)辛的鎮(zhèn)痛和抗炎作用[J].中國(guó)藥理與臨床，2011，27（2）：67-69.

[12] 潘金火，嚴(yán)國(guó)俊，宋娟.關(guān)木通小同炮制品中馬兜鈴酸A 的含量測(cè)定及其對(duì)大鼠腎功能的急性損傷試驗(yàn)[J].中藥材，2010，33（8）：1228-1233.

[13] 劉雅婧，李春杰，周英亮，等.不同產(chǎn)地細(xì)辛中有效成分與馬兜鈴酸Ⅰ含量差異比較[J].中國(guó)執(zhí)業(yè)藥師，2010，7（12）：29-33.

[14] 曹蕊，王錚，張春紅，等.RP-HPLC 法測(cè)定不同方法炮制關(guān)木通中馬兜鈴酸A 的含量[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，5（7）：28-30.

[15] 孫秀巖，孫啟時(shí)，賈凌云.HPLC 法測(cè)定種子經(jīng)處理后種植的遼細(xì)辛中馬兜鈴酸A 的含量[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，26（4）：299-302.

[16] 熊玉蘭，荊宇，尚明英，等.細(xì)辛非揮發(fā)性提取物抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].中國(guó)中藥雜志，2009，34（17）：2252.