雙分子印跡聚合物微球選擇固相萃取環(huán)境和食品樣品中壬基酚和雙酚A

韋壽蓮+劉玲+黎京華+汪洪武+劉永

摘 要 以壬基酚（NP）、雙酚A（BPA）為模板分子， a-甲基丙烯酸（MAA）為功能單體，通過乳液聚合法制備了雙模板分子印跡聚合物（D-MIP），并以D-MIP為固相萃取填料，建立了雙分子印跡固相萃取-高效液相色譜熒光檢測環(huán)境食品中痕量NP和BPA的方法。采用紅外光譜和吸附實驗對其性能進行了研究。結(jié)果表明， D-MIP對NP和BPA的飽和吸附量分別為73.3和97.5 mg/g，相對選擇性系數(shù)分別為2.2和1.7。在最佳條件下，本方法的線性范圍為0.01～2.3 mg/L （R2>0.998）， 檢出限（S/N=3）為0.001～0.002 mg/L。將本方法應(yīng)用于江水、啤酒、鯽魚中NP和BPA含量測定，回收率在86.4%～99.1%范圍內(nèi)，相對標準偏差小于6.2%。 本方法選擇性好、靈敏度高，對環(huán)境和食品中NP和BPA的富集、分離顯示出良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 雙模板分子印跡;壬基酚;雙酚A;固相萃取;高效液相色譜

1 引 言

烷基酚類和雙酚類內(nèi)分泌干擾物因廣泛存在各種環(huán)境介質(zhì)中，能干擾生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)而受到極大關(guān)注，尤其是壬基酚（NP）和雙酚A （BPA）^[1]。由于環(huán)境水體和食品中NP、BPA的含量低、基體復(fù)雜，在色譜分析前常需要進行樣品前處理^[2，3]。很多樣品前處理技術(shù)已經(jīng)用于提取不同樣品中的NP和BPA，如液液萃取^[4，5]、加速溶劑提取^[6，7]、Oasis或C18固相萃取^[8，9]等，但這些常規(guī)的提取技術(shù)缺乏選擇性。

分子印跡技術(shù)是制備在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點上與特定分子匹配的印跡聚合物。目前，制備NP或BPA分子印跡聚合物（MIPs）的方法多采用封管聚合法[10～13]。該方法簡單、合成條件易于控制，但所得MIPs顆粒形狀不規(guī)則，印跡位點包埋較深。乳液聚合法因可容易制備出粒徑可控、識別選擇性較高的印跡聚合物微球而受到青睞^[14]，但使用單一模板分子制備的MIPs同時去除復(fù)雜環(huán)境食品樣品中烷基酚類和雙酚類干擾物有其局限性。多數(shù)情況下，以BPA為模板分子制備的MIPs對烷基酚類物質(zhì)識別選擇性較差，反之亦然。Dickert等^[15]提出雙模板印跡的理念。用雙模板或多模板分子制備的MIPs包含兩種或多種印跡位點，可有效提高對不同類別目標分子的選擇性識別^{[16，17]}。目前，以NP和BPA為模板分子制備雙模板分子印跡聚合物尚未見文獻報道。

本實驗應(yīng)用雙模板的理念，結(jié)合乳液聚合的優(yōu)點，以壬基酚和雙酚A為雙模板分子，制備一種新型雙分子印跡聚合物，并將其作為固相萃取填料，結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測（HPLC-FID），建立了環(huán)境水樣、啤酒、鯽魚中痕量NP和BPA的固相萃取-HPLC-FID分析方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國 Agilent公司），UV/VIS 916 紫外可見分光光度計（澳大利亞GBC公司），F(xiàn)TIR-8400S紅外分光光度計（日本島津公司），SHA-B水浴恒溫振蕩器（深圳市億通科技有限公司），KUDOS SK8200H超聲清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），固相萃取裝置（北京康林科技公司）。

壬基酚（NP）、雙酚A（BPA）、3-氨基酚（3-AP）、對叔丁基苯酚（p-TBP）、a-甲基丙烯酸（MAA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、偶氮二異丁腈（AIBN），均為分析純（上海晶純試劑有限公司）;正十四烷、司盤80（Span80）和十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），均為分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）; 甲醇為色譜純; 實驗用水為 Milli-Q水（美國Millipore公司）。

2.2 色譜檢測條件

色譜柱為ODS-AP柱（250 mm× 4.6 mm， 5 μm），流動相：甲醇-水（95∶5， V/V），流速1.0 mL/min，熒光檢測：激發(fā)波長228 nm，發(fā)射波長305 nm; 進樣量20 μL。

2.3 乳化液的配制和分子印跡聚合物的制備

配制50 mL 1% 乳化液（含Span80-CTAB（3∶7， w/w），0.8 mmol十六烷）。超聲20 min，形成穩(wěn)定乳化液。

將0.22 g壬基酚、0.23 g雙酚A溶于5 mL氯仿，加入0.34 g MAA和4.2 g EGDMA，超聲5 min，通氮氣5 min，將其緩慢倒入盛有25 mL乳化液的反應(yīng)器中，超聲乳化20 min，加入50 mg AIBN，于80 ℃水浴中機械攪拌，通氮氣反應(yīng)17 h。所得聚合物離心抽濾，依次用乙醇、水洗滌多次，再用甲醇-乙酸（9∶1， V/V）溶液反復(fù)洗滌至紫外檢測不到壬基酚和雙酚A，最后用蒸餾水洗至中性，60 ℃真空干燥，得到分子印跡聚合物（MIP）。非印跡聚合物（NIP）的制備方法除不加入模板分子外，其余步驟同上。

2.4 吸附實驗

稱取30 mg MIPs 和NIPs多份，分別加入10 mL不同濃度（0.4， 0.6， 0.8， 1.0， 1.2， 1.5和1.8 g/L）BPA或NP溶液中，室溫振蕩2 h，離心分離，取上清液稀釋后，用紫外分光光度計分別在BPA和NP的最大吸收波長處測定其對應(yīng)的吸光度，根據(jù)吸附前后溶液濃度的變化，由方程Q=（c0-c）V/m計算聚合物對BPA和NP的吸附量Q（mg/g）。endprint

稱取30.0 mg MIP和NIP，分別加入10 mL 1.0 g/L BPA， NP， 3-AP和p-TBP溶液，室溫振蕩2 h，離心，取上清液稀釋后，用紫外分光光度計測各組分的平衡濃度，計算MIP和NIP對底物的選擇性系數(shù)。

2.5 樣品預(yù)處理

于2012年3月在肇慶市江濱碼頭進行單點表層采樣^[18]。采集的江水過0.22 μm 纖維素濾膜，于棕色玻璃瓶4 ℃貯存。 啤酒購自本地超市。取50 mL啤酒，超聲脫氣20 min。為去除單寧，加50 mL 1%聚乙烯醇6000，4 ℃溫育過夜， 4000 r/min離心20 min，過0.22 μm濾膜，置于棕色玻璃瓶、4 ℃貯存。

市購鯽魚6尾，重量500 g ± 200 g。將新鮮魚鰓和魚肉分別置于絞肉機中絞碎、勻漿成魚泥。稱取5 g魚泥置于50 mL離心管，加入5 mL乙腈，渦旋2 min，4000 r/min離心10 min，分離上清液，殘渣用5 mL乙腈重復(fù)提取一次。合并兩次上清液，60 ℃下氮氣吹至2 mL，進行固相萃取。

稱取200 mg MIPs，均勻裝填入商品SPE柱管（500 mg， 3 mL， 美國Supelco公司），加入篩板壓實， 制成MISPE柱。依次用20 mL甲醇-乙酸（9∶1， V/V）溶液、3 mL水、5 mL甲醇活化柱子。將1 mL含0.10 mg/L BPA和NP溶液上樣?？疾觳煌N類和不同用量的淋洗劑、洗脫劑對BPA、NP萃取回收率的影響，優(yōu)化萃取條件。

3 結(jié)果與討論

3.1 聚合物的FTIR光譜

3.2 吸附特性

圖2分別為MIP和NIP對NP， BPA的靜態(tài)吸附曲線。由圖2可見，MIP對NP和BPA的吸附在1.2 g/L達到飽和， NP， BPA的飽和吸附量分別為73.3 和97.5 mg/g。而相應(yīng)條件下，NIP對NP， BPA的飽和吸附量分別為27.8 和31.2 mg/g。MIP對NP， BPA的吸附量顯著高于NIP，這歸因于MIP分子印跡效應(yīng)形成的特異性識別的多靜電作用位點和空間結(jié)構(gòu)的互補性。

3.3 MIP的選擇識別能力

選擇3-氨基酚（3-AP）和對叔丁基苯酚（p-TBP）為結(jié)構(gòu)類似物，考察MIP的吸附選擇性。由實驗測得吸附量（Qe），根據(jù)公式（2～4）計算分配系數(shù)（Kd），選擇性系數(shù)（k）、相對選擇性系數(shù)（α），結(jié)果如表1。由表1可知，MIP對BPA， NP的吸附量和分配系數(shù)遠大于對3-AP和p-TBP;BPA， NP在MIP上的相對選擇性系數(shù)分別是NIP的2.2和1.7倍。以上結(jié)果表明， MIP對模板分子BPA和NP具有強的結(jié)合能力和高的選擇性。

3.4 固相萃取條件優(yōu)化

考察3 mL 0～20%（V/V）甲醇-水的淋洗效果。結(jié)果表明，當甲醇含量大于5%，隨甲醇用量增大，NP和BPA的損失緩慢增大，因此選擇5%甲醇-水為淋洗液?？疾炝芟匆河昧康挠绊憽＝Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，當淋洗液用量大于4 mL，NP和BPA有不同程度的損失。因此淋洗液用量選擇4 mL。

考察甲醇-水（9∶1， V/V）、純甲醇和甲醇-乙酸（9∶1， V/V）3種洗脫液的洗脫效果。結(jié)果表明，以甲醇-乙酸為洗脫液，NP、BPA的萃取回收率最高。這是由于乙酸能夠破壞分析物與印跡位點之間的氫鍵。相反，以甲醇-水為洗脫劑，NP、BPA的回收率最低，這是因為分析物的水溶性差; 而以純甲醇為洗脫劑，雜質(zhì)干擾比較大。因此，選擇甲醇-乙酸（9∶1， V/V）為洗脫劑?？疾煜疵搫┯昧繉腿』厥章实挠绊?。結(jié)果表明，隨洗脫劑用量的增加，NP、BPA的萃取回收率增加，6 mL時達最大，分別為98.8%和98.1%。因此，洗脫劑的用量選擇6 mL。

3.5 MISPE-HPLC-FID方法的建立

在優(yōu)化的條件下，分別對BPA， NP， 3-AP和p-TBP系列混合標準溶液進行萃取和HPLC分析。BPA和NP的線性范圍為0.01～2.3 mg/L，3-AP和p-TBP的線性范圍為0.0055～1.5 mg/L;BPA， NP， 3-AP和p-TBP線性方程分別為y= Symbolm@@ 0.12+2762.78x （R2=0.9994），y= Symbolm@@ 3.83 + 753.38x （R2=0.9987），y=19.00+10005.72x （R2=0.9992），y= Symbolm@@ 1.16 + 1207.16x （R2=0.9993），檢出限（S/N=3）為0.001～0.002 mg/L。對0.02 mg/L的BPA， NP， 3-AP和p-TBP水樣進行5次平行測定，相應(yīng)的回收率分別為98.1%， 97.3%， 91.6%和93.3%，RSD<5%。圖3為0.02 mg/L混合標準溶液的高效液相色譜圖。

3.6 實際樣品分析

將本方法用于江水、啤酒和鯽魚中BPA和NP的測定。圖4為江水樣品的HPLC圖，分析結(jié)果見表2。從圖4可見，樣品經(jīng)MISPE萃取后，可以有效去除基質(zhì)的干擾。由表2可知，江水和啤酒中未檢出BPA和NP;魚肉和魚鰓中未檢出NP，但分別檢出BPA，含量分別為3.3和11.0 ng/g; 魚鰓中BPA的含量是魚肉的3.3倍。4種樣品的加標回收率在86.4%～99.1%之間，RSD≤6.2%。

References

1 López-Darias J， Germn-Hernndez M， Pino V， Afonso A M. Talanta， 2010， 80（5）： 1611-1618

2 Ding W H， Wu C Y. J. Chinese Chem. Soci.， ?2000， ?47（5）： 1155-1160endprint

3 Zhao R S， Wang X， Yuan J P， Zhang L L. Microchim. Acta， ?2009， ?165（3）： 443-447

4 Wu M H， Wang L， Xu G， Liu N， Tang L， Zheng J， Bu T T， Lei B L. Environ. Monit. Assess， ?2013， ?185（11）： 3149-3161

5 Salgueiro-Gonzlez N， Concha-Graa E， Turnes-Carou I， Muniategui-Lorenzo S， López-Mahía P， Prada-Rodríguez D. J. Chromatogr. A， ?2012， ?1223： 1-8

6 Shao B， Han H， Li D M， Ma Y， Tu X M， Wu Y G. Food Chem.， ?2007， ?105（3）： ?1236-1241

7 Sun H， Ge X， Lv Y， Wang A. J.Chromatogr. A， ?2012， ?1237： 1-23

8 Vega-Morales T， Sosa-Ferrera Z， Santana-Rodríguez J J. J.Chromatogr. A， ?2012， ?1230： 66-76

9 Cao X L， Perez-Locas C， Dufresne G， Clement G， Popovic S， Beraldin F， Dabeka R W， Feeley M. Food Add. Cont.， ?2011， ?28： 791-798

10 XU Jing， WANG Huan-Huang， LIU Juan， ZHU Jing-Bo. Polyvinyl Chloride， ?2010， ?38（7）： 35-38

徐 靖， 汪歡晃， 劉 娟， 朱靜波. 聚氯乙烯， 2010， ?38（7）： 35-38

11 Du T， Cheng J， Wu M， Wang X， Zhou H， Cheng M. J.Chromatogr. B， ?2014， ?951-952： ?104-109

12 LIN Fu-Hua， HUANG Xiao-Jia， YUAN Dong-Xing， NONG Shu-Yu. Chinese J. Anal. Chem.， ?2012， ?40（2）： ?243-248

林福華， 黃曉佳， 袁東星， 農(nóng)舒予. 分析化學(xué)， 2012， ?40（2）： ?243-248

13 Wang Y X， Ding Y， Rong F， Fu D. Polym. Bull.， ?2012， ?68： 1255-1270

14 ZHU Li-Li， CAO Yu-Hua， CAO Guang-Qun. ?Chinese J. Anal. Chem.， ?2013， ?41（11）： 1724-1728

朱麗麗， 曹玉華， 曹光群. 分析化學(xué)， 2013， ?41（11）： 1724-1728

15 Dickert F， Achatz P， Halikias K. Fresen J. Anal. Chem.， ?2001， ?371（1）： 11-15

16 Xia X L， Lai E P C， rmeci B. Environ. Sci. Pollut. Res.， ?2013， ?20： 3331-3339

17 Zhang T， Ma C， Wu M， Ye Y， Chen H X， Huang J L. Microchim Acta， ?2013， ?180： ?695-702

18 Baggiani C， Baravalle P， Giovannoli C， Anfossi L， Giraudi G. Anal. Bioanal. Chem.， ?2010， ?397： 815-822

Selective Solid Phase Extraction of Nonylphenol and Bisphenol A

in Environmental and Food Samples Using Double-Molecularly

Imprinted Polymer Microsphere

WEI Shou-Lian*1， LIU Ling1， LI Jing-Hua2， WANG Hong-Wu1， LIU Yong1

1（Faculty of Chemistry and Chemical Engineering， Zhaoqing University， Zhaoqing 526061， China）

2（Blue Ribbon Beer Co. Ltd.， Zhaoqing 526040， China）

Abstract Double template molecularly imprinted polymer （D-MIP） was prepared by emulsion polymerization method using the nonylphenol （NP）， bisphenol A （BPA） as templates， α-methyl methacrylate（MAA） as functional monomer. Then using the D-MIP as solid phase extraction materials， a method based on double-molecularly imprinted solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatographic fluorescence detection was developed for the determination of trace NP and BPA from environmental and food samples. The D-MIP was characterized by Fourier transform infrared spectroscopy （FT-IR） and adsorption experiments. The results showed that the saturated adsorption capacity of the D-MIP for NP and BPA was 73.3 and 97.5 mg/g， respectively， and the relative selectivity coefficient was 2.2 and 1.7， respectively. Moreover， the conditions affecting extraction efficiency， such as washing conditions and desorption conditions were optimized. Under the optimal conditions， there was a good linear correlation in the concentration range of 0.01-2.3 mg/L with correlation coefficients （R2） greater than 0.998 for NP and BPA. The detection limits （S/N=3） were 0.001 and 0.002 mg/L. The proposed method was applied to determine NP and BPA in river water， beer and crucian carp samples. The recoveries of NP and BPA were in the range of 86.4%-99.1% with the relative standard deviation less than 6.2%. This method has good selectivity and high sensitivity and shows good prospects for the application in the enrichment and separation of NP and BPA in real samples.

Keywords Double-template molecularly imprinted; Nonylphenols; Bisphenol A; Solid phase extraction; High performance liquid chromatography

（Received 4 July 2014; accepted 8 October 2014endprint