吳雪瓊 梁艷 王國治

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·述評·

γ干擾素釋放試驗(yàn)臨床應(yīng)用的價(jià)值、問題與展望

吳雪瓊 梁艷 王國治

我國的結(jié)核病疫情和結(jié)核分枝桿菌(Mtb)感染情況都相當(dāng)嚴(yán)重。潛伏結(jié)核感染(latent tubercu-losis infection，LTBI)是宿主感染Mtb后、沒有結(jié)核病臨床表現(xiàn)和影像學(xué)改變的一種帶菌狀態(tài)。應(yīng)用PPD試驗(yàn)檢測，我國LTBI率約為44.5%～50.2%[1-2]；應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)檢測，健康人群LTBI率約為15.4%～30.7%[2-3]。LTBI者未經(jīng)治療約有5%～10%會(huì)發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核病，若同時(shí)伴有HIV感染，這種概率會(huì)更高，LTBI者是結(jié)核病患者的重要來源，新診斷的活動(dòng)性肺結(jié)核患者85%～90%是由其發(fā)展而來的。此外，2010年第五次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，15歲及以上人群活動(dòng)性肺結(jié)核的患病率為459/10萬，涂陽的肺結(jié)核患病率為66/10萬[4]，這意味著臨床結(jié)核病患者中85.6%的活動(dòng)性肺結(jié)核是菌陰患者。由此可見，LTBI和菌陰結(jié)核病的診斷和鑒別診斷是當(dāng)前結(jié)核病防控中面臨的重大難題。

盡管以結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn) (tuberculin skin test, TST)作為評價(jià)LTBI的方法存在爭議[5]，但長期以來PPD試驗(yàn)依然是臨床上最常用且最簡便的一種LTBI的主要檢測手段，反應(yīng)越強(qiáng)，表示結(jié)核感染可能性越大。由于PPD包含許多非結(jié)核分枝桿菌及卡介菌的共同抗原成分，因此PPD試驗(yàn)的特異度差，尤其是在實(shí)行卡介苗兒童計(jì)劃免疫的中國。近年來，γ干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assay, IGRA)作為一種新型的細(xì)胞免疫檢測技術(shù)已用于臨床檢測，但對其臨床價(jià)值存在較大爭議，為此中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)和《中華結(jié)核和呼吸雜志》編輯委員會(huì)組織專家撰寫了《γ干擾素釋放試驗(yàn)在中國應(yīng)用的建議》[6]。筆者對于IGRAs在臨床應(yīng)用過程中大家所關(guān)切的問題進(jìn)行闡述，并對其應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

IGRAs在臨床應(yīng)用中存在的問題

一、對IGRAs兩種技術(shù)的原理缺乏了解

目前，臨床上應(yīng)用的結(jié)核感染T細(xì)胞免疫檢測的IGRAs技術(shù)有兩種：一是ELISPOT；一是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。

IGRA-ELISPOT方法(也稱為細(xì)胞檢測)采用的ELISPOT技術(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與ELISA技術(shù)結(jié)合產(chǎn)生的新的檢測技術(shù)——固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)，可從 25萬個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中檢出每個(gè)分泌γ干擾素(IFN-γ)的細(xì)胞[7]。結(jié)核感染者PBMCs被Mtb特異性抗原刺激后，活化的T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞分泌的IFN-γ被位于細(xì)胞下方的包被在膜上的抗IFN-γ單克隆抗體所捕獲，洗去細(xì)胞后，通過酶聯(lián)免疫顯色，在膜上細(xì)胞分泌IFN-γ的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，通過顯微鏡人工計(jì)數(shù)或通過全自動(dòng)的斑點(diǎn)圖像分析儀計(jì)數(shù)斑點(diǎn)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)分泌IFN-γ的細(xì)胞，可計(jì)算出分泌IFN-γ細(xì)胞的頻率，這些細(xì)胞被稱為斑點(diǎn)形成細(xì)胞(spots forming cells，SFCs)。斑點(diǎn)的強(qiáng)弱和數(shù)量反映了機(jī)體效應(yīng)T細(xì)胞對刺激物的反應(yīng)能力和分泌IFN-γ的能力。因此，ELISPOT方法是在單細(xì)胞水平檢測IFN-γ的分泌情況，重點(diǎn)檢測活細(xì)胞的功能，即檢測單個(gè)細(xì)胞分泌IFN-γ的能力及分泌IFN-γ的細(xì)胞頻率，結(jié)果直觀、清楚；如果檢驗(yàn)員認(rèn)真遵循標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，重復(fù)性也較好，可直接反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。

IGRA-ELISA方法(全血檢測)采用的是經(jīng)典的ELISA技術(shù)，可從1 ml外周血中檢測出細(xì)胞分泌的IFN-γ的總量。結(jié)核感染者外周血經(jīng)Mtb特異性抗原刺激后，活化的T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和少量的造血干細(xì)胞等分泌產(chǎn)生IFN-γ，通過酶聯(lián)免疫顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出分泌IFN-γ的量。如果IFN-γ水平升高，既有可能是分泌IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量增加，也有可能是單個(gè)細(xì)胞的分泌水平增加所致。因此，ELISA方法是在群體細(xì)胞水平檢測IFN-γ的分泌情況，重點(diǎn)檢測IFN-γ的生成量，只是間接反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。

二、對IGRAs檢測結(jié)果的臨床意義不太清楚，認(rèn)識(shí)存在偏面性

IGRAs試驗(yàn)是通過人體的效應(yīng)T細(xì)胞是否被Mtb特異性抗原激活分泌IFN-γ，而間接地判斷機(jī)體內(nèi)是否存在Mtb感染。IGRAs檢測陽性說明存在Mtb感染，臨床上可用于LTBI的診斷、菌陰結(jié)核病的輔助診斷和鑒別診斷。ELISPOT斑點(diǎn)數(shù)越高，或IFN-γ水平越高，結(jié)核感染的可能性越大。目前IGRAs試劑盒主要以Mtb增殖期早期分泌抗原6(ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)為刺激劑，并不能區(qū)分是LTBI帶菌者還是活動(dòng)性結(jié)核病患者。此外，機(jī)體的反應(yīng)存在較大的個(gè)體差異，受機(jī)體免疫狀況的影響，也受疾病類型的影響。一般肺結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎和淋巴結(jié)核的陽性率高于骨關(guān)節(jié)結(jié)核。臨床應(yīng)用后發(fā)現(xiàn)也存在假陽性和假陰性問題，IGRAs陰性并不能排除LTBI的可能性，雖然在免疫功能低下、合并HIV感染、血液病、器官移植和使用免疫抑制劑等結(jié)核病患者中，IGRA-ELISPOT方法不受患者外周血淋巴細(xì)胞數(shù)差異的影響，較IGRA-ELISA更能客觀、準(zhǔn)確地反映機(jī)體對Mtb特異性的免疫功能，敏感度高于IGRA-ELISA方法和PPD試驗(yàn)，但部分患者T細(xì)胞功能異常，較免疫功能正常的結(jié)核病患者更易出現(xiàn)假陰性；而腫瘤等患者也可能出現(xiàn)非特異性的IFN-γ釋放而導(dǎo)致假陽性[8]，應(yīng)引起高度重視。

三、應(yīng)用目前商品化的IGRAs試劑盒檢測非血體液標(biāo)本的效果缺乏驗(yàn)證

部分實(shí)驗(yàn)室直接應(yīng)用目前商品化的IGRAs試劑盒直接檢測非血液標(biāo)本是不合適的，因?yàn)槟壳颁N售的IGRA-ELISPOT試劑盒和IGRA-ELISA試劑盒均是用于檢測血液標(biāo)本的，其檢測流程及界限值并不完全適用于非血體液標(biāo)本。目前國內(nèi)外多數(shù)報(bào)道應(yīng)用IGRA-ELISPOT方法[9-10]、少數(shù)報(bào)道應(yīng)用IGRA-ELISA方法檢測非血體液標(biāo)本[11-12](如胸腔積液、腦脊液、腹腔積液、支氣管灌洗液等)，結(jié)果顯示非血體液標(biāo)本IGRAs的敏感度及特異度高于血液標(biāo)本，胸腔積液ELISPOT檢測的假陽性率明顯低于血液標(biāo)本[9-10]，這是因?yàn)樾?yīng)T細(xì)胞在漿膜腔或支氣管黏膜局部浸潤、集聚所致。似乎胸腔積液采用IGRA-ELISPOT檢測的診斷效能高于IGRA-ELISA方法[10]，但目前研究報(bào)道較少，患者例數(shù)也不多。因此，尚需進(jìn)行大樣本量研究、確定IGRAs檢測非血體液標(biāo)本的操作流程、診斷標(biāo)準(zhǔn)和臨床價(jià)值，并獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局的臨床批文。IGRAs是否可用于檢測關(guān)節(jié)腔積液標(biāo)本也需進(jìn)一步研究。

四、以試劑盒的名稱作為IGRAs技術(shù)、方法的名稱不妥

目前，采用IGRA-ELISPOT方法的試劑盒主要有：英國牛津免疫技術(shù)公司研制的結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)試劑盒[以Mtb基因組差異區(qū)1(region of difference, RD1)中的 ESAT-6、CFP-10合成多肽為刺激抗原]和ELISpotPLUS試劑盒，后者在T.SPOT-TB試劑盒的基礎(chǔ)上摻入了Rv3879c(也位于RD1)多肽抗原，使其檢測靈敏度提高了4%[13]；上海銘源數(shù)康生物科技有限公司生產(chǎn)的F-SPOT結(jié)核分枝桿菌效應(yīng)T細(xì)胞檢測試劑盒(以CFP-10與ESAT-6融合蛋白為刺激劑)。采用IGRA-ELISA方法的試劑盒主要有：澳大利亞(Cellestis Limited, Carnegie, Victoria, Australia)制備的QuantiFERON?-TB test (QFT)試劑盒(以PPD抗原為刺激劑)和QuantiFERON?-TB Gold (QFT-G)試劑盒(以ESAT-6、CFP-10合成多肽為刺激抗原)；最近又出現(xiàn)了一種改良的試管方法QuantiFERON?-TB Gold In-Tube test(QFT-GIT)試劑盒(以ESAT-6、CFP-10和TB7.7合成多肽為刺激抗原，TB7.7位于RD13)[14]，這3個(gè)試劑盒均已獲得美國FDA批文，QFT-G試劑盒已獲得我國的醫(yī)療器械證書。北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的結(jié)核感染T細(xì)胞檢測試劑盒和海南?？赩TI公司生產(chǎn)的Mtb特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測試劑盒，兩者均以ESAT-6與CFP-10融合蛋白為刺激劑。由于T.SPOT-TB試劑盒首先在國內(nèi)推廣應(yīng)用，有些人將T.SPOT作為IGRA檢測的代名詞，這是不準(zhǔn)確的。

五、生產(chǎn)廠家對IGRAs檢測試劑盒的質(zhì)量控制需要加強(qiáng)

試劑盒中檢測試劑的生產(chǎn)應(yīng)注意下列幾個(gè)問題：淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)的質(zhì)量，這是有效分離PBMCs的關(guān)鍵試劑，F(xiàn)icoll質(zhì)量好，細(xì)胞回收率高；植物血凝素(PHA)很容易失效，應(yīng)關(guān)注；制備時(shí)大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白抗原的純度應(yīng)達(dá)到90%以上，以免導(dǎo)致假陽性；所有實(shí)驗(yàn)試劑、細(xì)胞培養(yǎng)板等均應(yīng)做無菌處理，應(yīng)注意無菌操作，以免發(fā)生污染；界限值的設(shè)定要合理。

六、兩種IGRAs方法操作步驟較多，對檢驗(yàn)技術(shù)人員的素質(zhì)及檢驗(yàn)質(zhì)量要求較高

操作人員認(rèn)真負(fù)責(zé)的態(tài)度，仔細(xì)、準(zhǔn)確的操作，將決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。IGRA-ELISPOT方法有一定的技術(shù)難度，尤其是PBMCs的分離、計(jì)數(shù)及形成斑點(diǎn)的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)是檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15]，要求加入孔中的活細(xì)胞數(shù)為2.5×105個(gè)，過多可能會(huì)導(dǎo)致假陽性，過少可能會(huì)導(dǎo)致假陰性；不能完全根據(jù)全自動(dòng)的斑點(diǎn)圖像分析儀的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)報(bào)告結(jié)果，對于處于臨界值的結(jié)果應(yīng)肉眼進(jìn)行核對。血液采集后最好在2～4 h內(nèi)分離，放置時(shí)間不要超過6 h，隨著放置時(shí)間的延長效應(yīng)T細(xì)胞的活化會(huì)受到影響，冷凍保存的PBMCs形成斑點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)減少，使檢測敏感度降低。操作中還應(yīng)注意避免對細(xì)胞的損傷和微生物的污染，以免導(dǎo)致假陰性結(jié)果或影響結(jié)果的判定。目前的IGRA-ELISPOT檢測較難實(shí)現(xiàn)高通量檢測，但其結(jié)果直觀、清楚、重復(fù)性較好，較適用于臨床檢驗(yàn)。

IGRA-ELISA方法相對比較成熟，操作簡便、快速、經(jīng)濟(jì)，通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出IFN-γ總量。若應(yīng)用自動(dòng)化的酶標(biāo)檢測儀較易實(shí)現(xiàn)高通量的檢測，較適用于體檢、篩查。其主要問題是無論是應(yīng)用儀器自動(dòng)化或手工操作，干擾因素較多，尤其是溫度和時(shí)間的影響最大，導(dǎo)致板與板間吸光度值差別大，批內(nèi)與批間的重復(fù)性不太好。

結(jié)核IGRAs試驗(yàn)在臨床應(yīng)用需要深入研究的問題

近年來IGRAs試驗(yàn)逐步在臨床推廣應(yīng)用，取得了顯著進(jìn)展，對其試驗(yàn)的本質(zhì)也有了較清醒的認(rèn)識(shí)，但I(xiàn)GRAs試驗(yàn)所反映的深層次的基礎(chǔ)問題及臨床意義值得我們更深入地探討。

一、IGRAs試驗(yàn)原理所反映的基礎(chǔ)問題

結(jié)核感染者PBMCs被Mtb特異性抗原刺激后，增殖、分化形成效應(yīng)T細(xì)胞并分泌細(xì)胞因子，其中分泌IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞通過IGRA-ELISPOT檢測，而分泌的IFN-γ通過IGRA-ELISA檢測。需要進(jìn)一步探討的問題是：(1)IGRA-ELISPOT試驗(yàn)所產(chǎn)生的斑點(diǎn)是Mtb特異性抗原刺激T細(xì)胞后所形成的效應(yīng)T細(xì)胞，還是效應(yīng)T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-12)進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)生的效應(yīng)T細(xì)胞？這種次級效應(yīng)有多強(qiáng)？次級效應(yīng)活化的T細(xì)胞和產(chǎn)生的IFN-γ是否是IGRA-ELISPOT和IGRA-ELISA產(chǎn)生假陽性的原因？(2)目前認(rèn)為ELISPOT的斑點(diǎn)代表分泌IFN-γ的細(xì)胞，斑點(diǎn)的數(shù)量和強(qiáng)弱反映了機(jī)體分泌IFN-γ的細(xì)胞的頻率和對刺激物的反應(yīng)能力，與機(jī)體的細(xì)胞免疫功能直接相關(guān)。但1個(gè)斑點(diǎn)是否真能代表1個(gè)分泌IFN-γ的細(xì)胞？斑點(diǎn)的大與小是如何形成的，有何意義？(3)目前結(jié)核感染的診斷沒有“金標(biāo)準(zhǔn)”，如何確定IGRAs的界限值以準(zhǔn)確地反映結(jié)核感染的真實(shí)情況。

二、PPD試驗(yàn)與兩種IGRAs方法的相關(guān)性

PPD試驗(yàn)與兩種IGRAs方法三者之間一致性差、相關(guān)性低[14,16]，目前LTBI的診斷缺乏金標(biāo)準(zhǔn)，無法評價(jià)PPD試驗(yàn)和兩種IGRAs方法診斷的準(zhǔn)確性。

1.PPD試驗(yàn)與兩種IGRAs方法一致性差的原因分析：(1)由于PPD中含有許多分枝桿菌(包括致病性分枝桿菌、環(huán)境中非致病性分枝桿菌和卡介菌)共同的抗原，理論上PPD試驗(yàn)診斷Mtb感染的特異度低，不能鑒別是Mtb感染還是接觸環(huán)境中非結(jié)核分枝桿菌或卡介苗接種后造成的致敏。而IGRA方法應(yīng)用ESAT-6和CFP-10作為抗原刺激劑，其編碼基因只存在于Mtb、牛結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌和4種非結(jié)核分枝桿菌(堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、微黃分枝桿菌)基因組中，在卡介苗和大多數(shù)環(huán)境非結(jié)核分枝桿菌基因組中缺失。筆者根據(jù)手臂上有無卡痕來判斷是否接種了卡介苗，590例(65.2%)平均年齡(19.3±1.6)歲的男性新兵有卡痕 [PPD試驗(yàn)硬結(jié)平均直徑(8.2±6.5)mm，IGRA-ELISPOT檢測SFCs平均為(12.2±21.2)個(gè)]，其中387例(65.6%)PPD試驗(yàn)陽性，硬結(jié)平均直徑為(12.1±4.4)mm；164例(27.8%)為ELISPOT陽性，平均SFCs為(13.5±23.8)個(gè)。315例(34.8%)無卡痕 [PPD試驗(yàn)硬結(jié)平均直徑(3.2±5.5)mm，IGRA-ELISPOT檢測SFCs平均為(18.3±34.6)個(gè)]，其中67例(21.3%)是PPD試驗(yàn)陽性，硬結(jié)平均直徑為(12.6±4.6)mm；113例(35.9%)為ELISPOT陽性，SFCs平均為(30.9±44.5)個(gè)。248例PPD試驗(yàn)陰性的無BCG接種者中，81例(32.7%)IGRA-ELISPOT檢測陽性[2]。由此可見，該人群的結(jié)核自然感染率為21.3%；在PPD試驗(yàn)陽性的卡介苗接種人群中扣除結(jié)核自然感染率，還有44.3%的PPD陽性者可能是由于卡介苗接種和環(huán)境非結(jié)核分枝桿菌感染所致。兩種IGRAs方法雖然敏感度低于PPD試驗(yàn)，但特異度高，不受卡介苗接種和環(huán)境非結(jié)核分枝桿菌感染的影響，這對于普種卡介苗的國家(如我國)是非常有益的，IGRAs方法能夠更有效地篩查結(jié)核感染。(2)PPD試驗(yàn)是將PPD注射于人體皮膚內(nèi)，激發(fā)Mtb感染的機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，激活T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，釋放大量細(xì)胞因子，并使這些細(xì)胞增殖、聚集，包裹抗原形成結(jié)節(jié)，被稱為遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(delayed-type hypersensitivity，IV型)。因此，PPD皮膚反應(yīng)可通過激活記憶T細(xì)胞反應(yīng)，檢測潛伏、休眠的Mtb感染，這可能是應(yīng)用PPD試驗(yàn)檢測LTBI人群的陽性率較高的另一個(gè)原因。由于LTBI者體內(nèi)的Mtb并不是完全處于靜息狀態(tài)，而是不定期增殖，即休眠期和復(fù)制期不定期地轉(zhuǎn)換。當(dāng)體內(nèi)Mtb增殖分泌蛋白ESAT-6、CFP-10激活致敏機(jī)體時(shí)，IGRAs檢測才可能出現(xiàn)陽性，因此，特異性IFN-γ應(yīng)答是依賴于抗原介導(dǎo)的效應(yīng)T細(xì)胞的存在，IGRAs檢測的是效應(yīng)T細(xì)胞而不是記憶T細(xì)胞，效應(yīng)T細(xì)胞存活時(shí)間短，檢測的是近期感染或“活動(dòng)性”感染，兩種IGRAs試驗(yàn)檢測LTBI 人群的陽性率低于PPD試驗(yàn)。如筆者對12例胸片上顯示肺部有鈣化點(diǎn)的新兵進(jìn)行PPD試驗(yàn)和ELISPOT試驗(yàn)，結(jié)果PPD試驗(yàn)100%陽性，硬結(jié)平均直徑(12.7±4.4)mm；而ELISPOT試驗(yàn)41.7%陽性，平均SFCs 為(15.5±11.6)個(gè)[17]。

2. IGRA-ELISPOT方法和IGRA-ELISA方法一致性差的原因分析：(1)從方法學(xué)上來說，ELISPOT技術(shù)是從單細(xì)胞水平進(jìn)行檢測，可及時(shí)捕獲細(xì)胞分泌于表面的細(xì)胞因子，因此，IGRA-ELISPOT檢測的敏感度高于IGRA-ELISA方法，可從25萬個(gè)細(xì)胞中檢出 1個(gè)分泌IFN-γ的細(xì)胞。(2)當(dāng)LTBI者體內(nèi)的Mtb真正處于潛伏、休眠狀態(tài)時(shí)，其效應(yīng)T細(xì)胞并不會(huì)被Mtb早期分泌蛋白ESAT-6、CFP-10所激活，而不分泌IFN-γ，此時(shí)IGRAs檢測呈現(xiàn)“假”陰性。(3)當(dāng)LTBI者體內(nèi)Mtb處于早期激活狀態(tài)時(shí)，少部分效應(yīng)T細(xì)胞被Mtb早期分泌蛋白ESAT-6、CFP-10所激活，但分泌IFN-γ的水平較低，應(yīng)用IGRA-ELISPOT方法可檢出所有分泌IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞，而IGRA-ELISA方法只能檢出那些群體效應(yīng)T細(xì)胞分泌的IFN-γ水平達(dá)到一定量的LTBI者。因此，在這部分人群IGRA-ELISPOT檢測的敏感度高于IGRA-ELISA。(4)而當(dāng)體內(nèi)Mtb處于高度活躍的增殖狀態(tài)時(shí)，結(jié)核“活動(dòng)”感染者(或稱結(jié)核感染高危人群)及活動(dòng)性結(jié)核病患者的效應(yīng)T細(xì)胞分泌的IFN-γ水平較高，IGRA-ELISPOT和IGRA-ELISA方法檢測的敏感度相似。

三、IGRAs檢測與結(jié)核病患者臨床狀況的關(guān)系

目前關(guān)于IGRA-ELISPOT檢測的斑點(diǎn)數(shù)或IGRA-ELISA檢測的IFN-γ水平與結(jié)核病患者臨床狀況的關(guān)系尚存在爭議。部分Mtb感染者中可檢出大量SFCs和高水平的IFN-γ[2,18]；張娟等[19]和吳雪瓊等[20]的研究結(jié)果也顯示，初治結(jié)核病患者檢測的斑點(diǎn)數(shù)明顯高于復(fù)治患者，大多數(shù)菌陽患者檢測的斑點(diǎn)數(shù)顯著高于菌陰的患者，肺部有空洞患者檢測的斑點(diǎn)數(shù)明顯高于無空洞的患者，中青年患者檢測的斑點(diǎn)數(shù)明顯高于老年患者。這些現(xiàn)象說明機(jī)體免疫功能正常時(shí)，斑點(diǎn)數(shù)越多或IFN-γ水平越高，則Mtb在體內(nèi)增殖的可能性越大，結(jié)核活動(dòng)程度越高，機(jī)體調(diào)動(dòng)細(xì)胞免疫抗結(jié)核的作用越強(qiáng)，結(jié)核“活動(dòng)性”感染或活動(dòng)性結(jié)核病的可能性越大；這些現(xiàn)象與機(jī)體細(xì)胞免疫狀況密切相關(guān)，但與結(jié)核病嚴(yán)重程度不一定有關(guān)系；是否與體內(nèi)Mtb載量相關(guān)尚需進(jìn)一步研究。

結(jié)核“活動(dòng)性”感染者或活動(dòng)性結(jié)核病患者IGRAs檢測大多數(shù)為陽性，SFCs或IFN-γ水平增高；經(jīng)過有效抗結(jié)核治療后，體內(nèi)Mtb被殺滅或抑制，抗原分泌減少，誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答降低，IGRAs再次檢測時(shí)活化的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)減少，釋放IFN-γ的水平下降，部分受檢者下降至界限值以下，使IGRAs的檢測結(jié)果由陽性轉(zhuǎn)陰性。

四、卡介苗接種對IGRAs檢測的影響

理論上卡介苗接種不影響IGRAs檢測的特異度。目前，我軍駐京部隊(duì)仍實(shí)行對PPD試驗(yàn)陰性的入伍新兵進(jìn)行卡介苗接種的策略，筆者多次研究結(jié)果均證實(shí)卡介苗接種前后(3或10個(gè)月后)，IGRA-ELISPOT檢測的SFCs數(shù)量基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[16,21-22]。對892例入伍新兵檢測血液中IFN-γ水平，579例有卡痕者 [(261.2±239.0)pg/ml] 和313例無卡痕者 [(269.8±238.3)pg/ml]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)[18]。顯然，卡介苗雖具有免疫增強(qiáng)作用，但I(xiàn)GRAs檢測不受卡介苗接種的影響，這對于普種卡介苗國家進(jìn)行LTBI者的篩查及結(jié)核病的防控具有現(xiàn)實(shí)的意義。

五、腫瘤對IGRAs檢測的影響

IGRAs檢測應(yīng)用于臨床后，發(fā)現(xiàn)肺癌和癌性胸膜炎的患者也會(huì)出現(xiàn)IGRAs陽性。筆者的研究顯示約15%的胸部腫瘤IGRA-ELISPOT會(huì)出現(xiàn)假陽性(未發(fā)表資料)；劉旭輝等[23]報(bào)道肺癌患者T-SPOT.TB的假陽性率為27.3%，而黃毅等[8]應(yīng)用IGRA-ELISA檢測肺癌和肺炎的假陽性率分別為50%和29.3%，不同類型肺癌患者之間的假陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤患者出現(xiàn)IGRAs檢測陽性的可能原因如下：(1)腫瘤患者可能同時(shí)合并結(jié)核感染，一部分肺癌患者是由肺結(jié)核惡變產(chǎn)生的；(2)抗腫瘤免疫也主要是由細(xì)胞免疫介導(dǎo)的，部分腫瘤效應(yīng)T細(xì)胞在ESAT-6和CFP-10蛋白刺激下也會(huì)非特異性地釋放IFN-γ，這就是卡介苗制劑具有非特異性免疫增強(qiáng)作用，30多年來一直用于腫瘤(尤其是膀胱癌)輔助治療的主要原因。因此， IGRAs檢測在腫瘤患者中的假陽性問題應(yīng)引起臨床大夫的高度重視，該方法無法鑒別結(jié)核感染和腫瘤。但還需進(jìn)一步擴(kuò)大腫瘤患者的樣本量，深入地研究Mtb特異性抗原是誘導(dǎo)少數(shù)還是多數(shù)腫瘤效應(yīng)T細(xì)胞，非特異性地釋放低水平的還是高水平的IFN-γ，這對于了解兩種IGRAs方法的特異性，更好地確定鑒別診斷的界限值是非常有意義的。

六、PPD試驗(yàn)和IGRAs檢測陽性患者未來發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)評估

目前的研究顯示，無論是PPD試驗(yàn)強(qiáng)陽性者還是IGRAs陽性者未來發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病的只是少數(shù)。筆者隨訪132例PPD強(qiáng)陽性和278 例ELISPOT陽性的戰(zhàn)士18個(gè)月，均未發(fā)病[17]； Bakir等[24]隨訪381例T-SPOT.TB陽性的涂陽肺結(jié)核患者接觸者，最終11例(2.9%)發(fā)病。由此可見，這3種方法的檢測結(jié)果只反映受試者當(dāng)時(shí)機(jī)體對Mtb抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答狀況，間接說明機(jī)體是否感染Mtb，并不能預(yù)測Mtb感染者未來發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。但李晉等[25]應(yīng)用PPD試驗(yàn)和IGRA-ELISPOT方法同時(shí)檢測138例肺結(jié)核患者密切接觸者，跟蹤隨訪2年，結(jié)果11例(8.0%)發(fā)生活動(dòng)性肺結(jié)核??；未發(fā)病和發(fā)病人群第一次PPD試驗(yàn)陽性率(66.9%和63.6%)和ELISPOT試驗(yàn)陽性率(33.1%和72.7%)比較，PPD試驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.8241)；ELISPOT試驗(yàn)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0087)。盡管ELISPOT陽性者發(fā)生結(jié)核病的可能性大于ELISPOT陰性者，但ELISPOT陰性者人群數(shù)量遠(yuǎn)大于ELISPOT陽性者，就發(fā)病數(shù)量而言不一定會(huì)低于ELISPOT陽性者。鑒于結(jié)核感染者未來是否發(fā)病存在很大的個(gè)體差異、受諸多因素的影響，因此，結(jié)核發(fā)病高危人群的篩查仍是未來需要重點(diǎn)攻克的難關(guān)之一。

展 望

目前，盡管就機(jī)體對Mtb感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答進(jìn)行了大量的研究，并建立了一些新的結(jié)核病免疫診斷方法，IGRAs檢測技術(shù)在臨床推廣應(yīng)用，未來可能成為臨床免疫學(xué)檢測的主要方法，但它只是診斷結(jié)核感染的方法，在技術(shù)、方法上還需不斷地發(fā)展、完善，仍有許多問題值得進(jìn)一步進(jìn)行研究。

1. 細(xì)胞刺激抗原的篩選：Mtb分泌蛋白和細(xì)胞壁表面的蛋白是主要的免疫反應(yīng)抗原，有必要對Mtb抗原進(jìn)行進(jìn)一步分析、篩選、比較、制備，以獲得特異、高效的純化抗原，為結(jié)核感染的免疫診斷奠定基礎(chǔ)。

2. 結(jié)核感染不同時(shí)期分子標(biāo)志物的研究：通過對不同Mtb感染狀態(tài)下抗原生物學(xué)特性的研究，了解Mtb感染休眠期、Mtb感染增殖期、結(jié)核病非活動(dòng)期、結(jié)核病活動(dòng)期、耐藥結(jié)核病和肺外結(jié)核的抗原結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)新的診斷分子標(biāo)志物，以鑒別結(jié)核感染與發(fā)病。

3. 多種細(xì)胞因子聯(lián)合檢測：部分結(jié)核病患者IGRAs檢測陰性，IFN-γ水平不升高，與其他細(xì)胞因子(如IP10)聯(lián)合檢測可提高檢測的敏感度。

4.建立新的免疫診斷體系：通過研究診斷試劑中的關(guān)鍵原料，如標(biāo)記物、新型納米材料、示蹤染料等，建立新的免疫診斷體系，如IGRAs化學(xué)發(fā)光或熒光檢測試劑盒的開發(fā)將會(huì)提高檢測的敏感度。

5.建立免疫診斷評價(jià)體系：針對我國結(jié)核病的特點(diǎn)，建立供結(jié)核病免疫診斷制品實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制用的標(biāo)準(zhǔn)品、參考品和評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；建立規(guī)范的結(jié)核病免疫診斷試劑臨床評價(jià)體系，使新的免疫診斷方法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品化成為可能。

6.加強(qiáng)實(shí)用性免疫檢測儀器的研發(fā)：研發(fā)相配套的免疫檢測儀器，達(dá)到簡化操作、提高結(jié)果判斷的客觀性和準(zhǔn)確性的目的，同時(shí)實(shí)現(xiàn)高通量的檢測，節(jié)省人力。

7. “產(chǎn)學(xué)研用”相結(jié)合：整合科研單位和企業(yè)的優(yōu)勢資源，聯(lián)合攻關(guān)，將免疫基礎(chǔ)研究的創(chuàng)新成果有效地轉(zhuǎn)化為診斷產(chǎn)品，服務(wù)于臨床，接受臨床的驗(yàn)證，并進(jìn)一步改進(jìn)、創(chuàng)新。

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(本文編輯：薛愛華)

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.002

100091北京，解放軍第三〇九醫(yī)院 全軍結(jié)核病研究所 全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(吳雪瓊、梁艷)；中國食品藥品檢定研究院菌苗一室(王國治)

吳雪瓊，Email: xueqiongwu@139.com

2015-06-07)