張娟 孫嬌 李瑩 王悅 孫秀華 馬靜紅 邢黎莉 譚珂 彭嬌 孫炳奇

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·論著·

1873例結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測陽性患者的臨床分析

張娟 孫嬌 李瑩 王悅 孫秀華 馬靜紅 邢黎莉 譚珂 彭嬌 孫炳奇

目的 探討結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)檢測結(jié)果與結(jié)核病患者臨床表現(xiàn)的相關(guān)性。方法 選取臨床確診結(jié)核病且T-SPOT.TB檢測陽性患者1873例，并從患者的基本情況、細(xì)菌學(xué)、影像學(xué)及常規(guī)檢查等4個(gè)方面對T-SPOT.TB檢測結(jié)果[SFCs(個(gè))/106PBMCs]與結(jié)核病患者臨床表現(xiàn)的相關(guān)性進(jìn)行比較分析。結(jié)果 初治患者外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中斑點(diǎn)形成細(xì)胞 (SFCs)數(shù) [A孔中位數(shù)17個(gè)，B孔中位數(shù)13個(gè)]明顯高于復(fù)治患者[A孔中位數(shù)9個(gè)，B孔中位數(shù)9個(gè)] (A孔U=364 391.5，P<0.01；B孔U=364 259.0，P<0.01)；中青年患者SFCs數(shù)[A孔中位數(shù)17個(gè)，B孔中位數(shù)12個(gè)]明顯高于老年患者[A孔中位數(shù)9個(gè)，B孔中位數(shù)9個(gè)](A孔U=304 368.5，P<0.01；B孔U=302 802.0，P<0.01)；菌陽患者的SFCs數(shù)[A孔中位數(shù)27個(gè)，B孔中位數(shù)20個(gè)]明顯高于菌陰患者[A孔中位數(shù)10個(gè)，B孔中位數(shù)10個(gè)](A孔U=298 504.0，P<0.01；B孔U=279 815.5，P<0.01)；肺部有空洞的患者SFCs數(shù)[A孔中位數(shù)32個(gè)，B孔中位數(shù)25個(gè)]明顯高于肺部無空洞的患者[A孔中位數(shù)10個(gè)，B孔中位數(shù)9個(gè)](A孔U=208 015.5，P<0.01；B孔U=216 424.5，P<0.01)；外周血單核細(xì)胞升高的患者SFCs數(shù)[A孔中位數(shù)21個(gè)，B孔中位數(shù)20個(gè)]明顯高于外周血單核細(xì)胞正常的患者[A孔中位數(shù)10個(gè)，B孔中位數(shù)9個(gè)](A孔U=308 522.0，P<0.01；B孔U=307 748.0，P<0.01)。結(jié)論 T-SPOT.TB的SFCs計(jì)數(shù)雖然并不能完全與結(jié)核病活動程度呈正相關(guān)，但仍然存在著結(jié)核病活動程度越高SFCs數(shù)越多的趨勢。

潛伏性結(jié)核/診斷； 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測定

結(jié)核病是危害人類生命健康的主要疾病之一，是當(dāng)今世界單一致病菌引起死亡率最高的疾病，占世界總死亡率的第七位。直到今天，全球結(jié)核病仍呈持續(xù)蔓延之勢[1]。因此，快速準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病及有效控制結(jié)核病的蔓延成為至關(guān)重要的問題。近年來γ-干擾素釋放試驗(yàn) (interferon gamma release assay，IGRA)方法之一的結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)檢測技術(shù)，因其高特異度和高敏感度越來越廣泛地應(yīng)用于結(jié)核病[尤其是潛伏性結(jié)核感染(LTBI)]的臨床診斷，但是卻很少有報(bào)告探討T-SPOT.TB 檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中斑點(diǎn)形成細(xì)胞 (SFCs)數(shù)[SFCs(個(gè))/106PBMCs]與臨床癥狀的相關(guān)性。本研究對結(jié)核病患者T-SPOT.TB 檢測結(jié)果與臨床癥狀的相關(guān)性進(jìn)行探討，希望此項(xiàng)檢測結(jié)果能夠?yàn)榕R床診治提供更多的參考依據(jù)。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析本院2013年8月至2014年8月臨床確診為結(jié)核病、且T-SPOT.TB檢測陽性的患者1873例，平均年齡(49.67±18.72)歲；其中男1156例，平均年齡(50.60±18.18)歲；女717例，平均年齡(48.18±19.49)歲。所有患者均排除糖尿病、艾滋病等免疫系統(tǒng)缺陷性疾病。

二、分組方法

肺結(jié)核并發(fā)癥、初治和復(fù)治、肺結(jié)核和肺外結(jié)核、菌陰和菌陽結(jié)核病患者分組標(biāo)準(zhǔn)均參照《肺結(jié)核診斷和治療指南》[2]。本研究涉及的單核細(xì)胞正常值為(0.1～0.6)×109/L，淋巴細(xì)胞正常值為(1.1～3.2)×109/L。

三、T-SPOT.TB試驗(yàn)

應(yīng)用上海復(fù)星醫(yī)藥科技有限公司提供的結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)診斷試劑盒，按試劑盒說明書進(jìn)行檢測判斷結(jié)果。其中A孔和B孔為平行檢測孔，A孔內(nèi)包被早期分泌性靶抗原6 (early secretory antigenic target 6，ESAT-6)，B孔內(nèi)包被培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)抗原。結(jié)果判讀：空白對照孔內(nèi)SFCs<10個(gè)且陽性對照孔內(nèi)SFCs>20個(gè)時(shí)視為實(shí)驗(yàn)有效。當(dāng)ESAT-6或CFP-10任一檢測孔達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)則判定為陽性結(jié)果：①如果空白對照孔SFCs<5個(gè)，檢測孔SFCs減去空白對照孔SFCs≥6個(gè)。②如果空白對照孔SFCs≥6個(gè)，檢測孔SFCs必須>2倍的空白對照孔SFCs。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和上下四分位數(shù)表示，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同人群外周血T-SPOT.TB檢測結(jié)果

表1所示，在全體患者中，有1219例初治患者，654例復(fù)治患者，初治患者的A孔和B孔SFCs顯著高于復(fù)治患者，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A孔U=364 391.5，P<0.01；B孔U=364 259.0，P<0.01)，而男性和女性之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A孔U=414 760.0，P>0.05；B孔U=416 904.5，P>0.05)。中青年(16～60歲)A孔和B孔SFCs顯著高于老年(>60歲)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A孔U=304 368.5，P<0.01；B孔U=302 802.0，P<0.01)。

二、肺結(jié)核組與肺外結(jié)核組外周血T-SPOT.TB檢測結(jié)果

表2所示，在1873例患者中，有1498例肺結(jié)核患者，375例肺外結(jié)核患者，肺結(jié)核組與肺外結(jié)核組A孔和B孔SFCs差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A孔U=279 633.0，P>0.05；B孔U=288 622.0，P>0.05)。

表1 不同患者外周血T-SPOT.TB檢測結(jié)果

注 表1 中年齡分組未包括小兒患者，因?yàn)樵摻M患者只有9例，樣本數(shù)太少，故未單獨(dú)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表2 肺結(jié)核組與肺外結(jié)核組外周血T-SPOT.TB檢測結(jié)果

三、菌陰與菌陽結(jié)核病組外周血T-SPOT.TB檢測結(jié)果

表3 所示，在1873例患者中，有1549例患者進(jìn)行了細(xì)菌學(xué)檢查，其中1067例菌陰患者，482例菌陽患者。菌陽患者A孔和B孔斑點(diǎn)中位數(shù)分別為27和20個(gè)，顯著高于菌陰組的10和10個(gè)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A孔U=298 504.0，P<0.01；B孔U=279 815.5，P<0.01)。

四、結(jié)核病患者有無并發(fā)癥的外周血T-SPOT.TB檢測結(jié)果

如表4所示，在1873例患者中，合并呼吸衰竭等并發(fā)癥的患者為110例，但結(jié)核病患者有無并發(fā)癥并未對T-SPOT.TB檢測的SFCs造成明顯影響，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((A孔U=104 122.0，P>0.05；B孔U=92 436.5，P>0.05)。

五、結(jié)核病影像學(xué)所見有無空洞和鈣化患者的外周血T-SPOT.TB檢測結(jié)果

表5所示，在1873例患者中，有323例患者肺部影像學(xué)顯示有空洞，空洞組患者SFCs顯著高于無空洞組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A孔U=208 015.5，P<0.01；B孔U=216 424.5，P<0.01)。鈣化組與無鈣化組患者間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A孔U=175 777.0，P>0.05；B孔U=192 415.0，P>0.05)；而鈣化<3年組患者的SFCs明顯多于鈣化>3年組，其中A孔的結(jié)果兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A孔U=3180.0，P>0.05)，B孔的結(jié)果兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(B孔U=28 805.0，P<0.05)。

六、血常規(guī)是否異?；颊叩耐庵苎猅-SPOT.TB檢測結(jié)果

表6所示，1867例患者進(jìn)行血常規(guī)檢測，單核細(xì)胞絕對值升高的患者523例，單核細(xì)胞絕對值正?；颊?341例，單核細(xì)胞絕對值降低患者僅3例，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。淋巴細(xì)胞絕對值升高者32例，淋巴細(xì)胞絕對值正常者1459例，淋巴細(xì)胞絕對值降低者376例。單核細(xì)胞升高組A孔和B孔SFCs均明顯高于單核細(xì)胞正常組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A孔U=308 522.0，P<0.01；B孔U=307 748.0，P<0.01)；而淋巴細(xì)胞異常組中僅有淋巴細(xì)胞降低組A孔與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=249 017.0，P<0.01)。

表3 菌陰與菌陽結(jié)核病組外周血T-SPOT.TB檢測結(jié)果

表4 結(jié)核病患者有無并發(fā)癥的外周血T-SPOT.TB檢測結(jié)果

表5 結(jié)核病影像學(xué)所見有無空洞和鈣化患者的外周血T-SPOT.TB檢測結(jié)果

表6 血常規(guī)是否異常患者的外周血T-SPOT.TB檢測結(jié)果

七、同組內(nèi)A孔和B孔SFCs中位數(shù)比較

表7所示，對于同組內(nèi)樣本的A孔和B孔SFCs進(jìn)行比較，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，只有有鈣化組患者的A孔和B孔間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.141，P<0.05)，其他組內(nèi)A孔和B孔SFCs差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。

表7 同組內(nèi)A孔和B孔SFCs中位數(shù)比較

討 論

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種細(xì)胞因子檢測技術(shù)[3]。目前研究認(rèn)為T-SPOT.TB技術(shù)能夠較敏感地診斷出LTBI[4-8]，然而T-SPOT.TB診斷結(jié)果與結(jié)核病患者臨床表現(xiàn)之間是否具有一定的相關(guān)性[9]，目前尚無深入研究。本研究回顧性分析了1873例T-SPOT.TB陽性的結(jié)核病臨床確診患者，并從患者的基本情況、細(xì)菌學(xué)、影像學(xué)及常規(guī)檢查4個(gè)方面分析了T-SPOT.TB檢測結(jié)果與結(jié)核病患者臨床表現(xiàn)之間的相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)，初治患者SFCs顯著高于復(fù)治患者 (P<0.01)，可能由于復(fù)治結(jié)核病患者的免疫功能受到抑制，T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答能力下降。且復(fù)治結(jié)核病患者隨著病情進(jìn)展，機(jī)體細(xì)胞免疫功能進(jìn)一步下降，并逐步缺乏相應(yīng)的免疫效應(yīng)，細(xì)胞激活或免疫抑制進(jìn)一步加重，減弱了T淋巴細(xì)胞亞群對結(jié)核分枝桿菌的殺滅作用。在對中青年組與老年組的比較發(fā)現(xiàn)，中青年組A孔和B孔SFCs均顯著高于老年組 (P<0.01)，可能是與老年患者免疫功能低下，尤其是免疫屏障功能降低(T淋巴細(xì)胞增殖及活性降低)有關(guān)。由此表明，盡管以前的研究認(rèn)為T-SPOT.TB檢測結(jié)果受受試者免疫狀態(tài)影響較小[10-11]，但在應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)時(shí)，也應(yīng)盡量考慮到受試者的免疫因素干擾[12]。

在分析的1873例患者中，其中有1549例患者進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查，482例菌陽患者A孔和B孔SFCs數(shù)顯著高于菌陰組(1067例)(P<0.01)，表明T-SPOT.TB檢測的SFCs數(shù)高低與患者的荷菌量有一定關(guān)系，這與以往的一些報(bào)道是一致的[13-14]。Tsao等[15]發(fā)現(xiàn)高細(xì)菌負(fù)荷肺結(jié)核患者的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中IFN-γ水平最高，因此認(rèn)為IFN-γ是局部炎性部位的細(xì)菌負(fù)荷標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，患者T-SPOT.TB 檢測的SFCs隨著痰菌數(shù)量增加而上升，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果是一致的。國外文獻(xiàn)報(bào)道，痰菌陽性程度與T-SPOT.TB檢測的SFCs數(shù)高低有關(guān)[16]。有學(xué)者分別對結(jié)核感染患者在結(jié)核感染治療的最初2周內(nèi)、治療結(jié)束時(shí)及治療結(jié)束6個(gè)月后進(jìn)行T-SPOT.TB及產(chǎn)生特異性抗原的外周血單核細(xì)胞數(shù)(即SFCs數(shù))的檢測，結(jié)果顯示隨著治療的深入，T-SPOT.TB的陽性率降低，陽性患者的SFCs數(shù)呈下降趨勢[17]。然而，也有一些研究認(rèn)為，細(xì)菌負(fù)荷量與T-SPOT.TB檢測結(jié)果呈負(fù)相關(guān)，即高菌負(fù)荷的肺結(jié)核患者的外周血T淋巴細(xì)胞在受到特異性結(jié)核抗原刺激后存在產(chǎn)生IFN-γ缺陷[18-19]?？傊谓Y(jié)核患者外周血和BALF中的T-SPOT.TB 聯(lián)合檢測對于評估肺結(jié)核嚴(yán)重程度將有更大的臨床意義。

本研究中，肺部影像學(xué)顯示有空洞的患者323例，T-SPOT.TB檢測結(jié)果的SFCs數(shù)顯著高于無空洞組，這與一些學(xué)者研究的結(jié)果是相反的。Dlugovitzky等[20]比較肺結(jié)核不同程度病變范圍與IFN-γ水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)重度肺結(jié)核患者的IFN-γ水平顯著低于中度肺結(jié)核患者。也有研究顯示空洞肺結(jié)核患者的IFN-γ釋放水平與無空洞肺結(jié)核患者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且認(rèn)為空洞是否出現(xiàn)是感染細(xì)菌的數(shù)量、毒力及機(jī)體免疫功能共同作用的結(jié)果，結(jié)核分枝桿菌的毒力或許對空洞形成的影響更大[18]。因此，我們尚需進(jìn)行進(jìn)一步研究，來檢測機(jī)體免疫細(xì)胞的功能。本研究肺部影像學(xué)存在鈣化的患者為217例，其中鈣化<3年的患者T-SPOT.TB結(jié)果顯著高于鈣化>3年的患者(P<0.05)。這在一定程度上說明了當(dāng)結(jié)核病處于活動期時(shí)，T-SPOT.TB 檢測的SFCs數(shù)會在一定程度上呈上升趨勢，T-SPOT.TB檢測SFCs可以作為結(jié)核病是否處于活動期的一個(gè)輔助診斷指標(biāo)。

在機(jī)體介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)中，單核巨噬細(xì)胞是結(jié)核分枝桿菌的主要棲居地，也是宿主抗原提呈細(xì)胞和抗菌的主要效應(yīng)細(xì)胞；而淋巴細(xì)胞是主要的免疫調(diào)控細(xì)胞，因此，從PBMC研究結(jié)核病發(fā)病的機(jī)體免疫機(jī)制具有重要的意義。本研究從血常規(guī)檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞升高組的患者其T-SPOT.TB檢測的SFCs數(shù)顯著高于單核細(xì)胞正常組(P<0.01)，這可能與單核細(xì)胞的生理功能有關(guān)。單核細(xì)胞是巨噬細(xì)胞的前身，能吞噬、清除受傷衰老的細(xì)胞及其碎片；另外還參與免疫反應(yīng)，在吞噬抗原后將所攜帶的抗原決定簇轉(zhuǎn)交給淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)[21]。由于單核細(xì)胞是結(jié)核感染免疫的重要起始和效應(yīng)細(xì)胞，因此在活動性結(jié)核病中，單核細(xì)胞數(shù)量會明顯上升，這與單核細(xì)胞升高組進(jìn)行T-SPOT.TB檢測的SFCs數(shù)較高的結(jié)果是一致的。另外，淋巴細(xì)胞降低組T-SPOT.TB檢測的A孔SFCs數(shù)明顯低于正常組(P<0.01)，這可能是由于結(jié)核感染免疫時(shí)淋巴細(xì)胞大量聚集于結(jié)核感染病灶，造成外周循環(huán)中淋巴細(xì)胞數(shù)量下降，活性T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，最終導(dǎo)致T-SPOT.TB檢測的SFCs數(shù)較少。

此外，本研究肺結(jié)核與肺外結(jié)核患者進(jìn)行T-SPOT.TB檢測的SFCs數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是與檢測所用的標(biāo)本類型有關(guān)。本回顧性分析的所有T-SPOT.TB檢測數(shù)據(jù)均來源于外周血，而對于肺外結(jié)核來說，對其他類型的標(biāo)本進(jìn)行檢測往往更有意義[22]。例如，對疑似結(jié)核性腹膜炎患者的腹腔積液進(jìn)行檢測，對于結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液進(jìn)行檢測。因此，尚需要對相關(guān)類型的標(biāo)本進(jìn)行T-SPOT.TB檢測來進(jìn)一步研究后得出結(jié)論。

本研究還對同組內(nèi)T-SPOT.TB檢測結(jié)果的A孔和B孔SFCs數(shù)進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了鈣化組之外，其他組內(nèi)A孔和B孔SFCs數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，本研究并未發(fā)現(xiàn)人群對CFP-10和ESAT-6兩種抗原反應(yīng)性T-SPOT.TB檢測結(jié)果的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大樣本量加以證實(shí)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB檢測的SFCs數(shù)雖然并不完全與結(jié)核病活動程度呈正相關(guān)，但仍然存在著結(jié)核病活動程度越高SFCs數(shù)越多的趨勢。

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(本文編輯：薛愛華)

Clinical analysis of positive T-SPOT.TB in 1873 cases with active tuberculosis

ZHANG Juan, SUN Jiao, LI Ying, WANG Yue, SUN Xiu-hua, MA Jing-hong, XING Li-li, TAN Ke, PENG Jiao, SUN Bing-qi.

Tuberculosis Laboratory, Shenyang Chest Hospital, Shenyang 110044, China

SUN Bing-qi，Email:Sunbq2004@163.com

Objective To explore the relationship between the spot-forming cells (SFCs) of T-SPOT.TB and clinical manifestation of tuberculosis. Methods One thousand eight hundred and seventy three patients with active tuberculosis and T-SPOT.TB positive result were enrolled in this study. The correlation between T-SPOT.TB results and clinical manifestations of tuberculosis patients was compared and analyzed based on the demographic data, bacteriology，imaging characteristics and blood routine examination. Results The median of SFCs of T-spot in primary patients (A:17，B:13)was significantly higher than that of retreatment patients(A: 9，B: 9) (Uvalue of A was 364 391.5，P<0.01；Uvalue of B was 364 259.0，P<0.01)；The median of SFCs of T-spot in young to middle-aged patients (A:17，B: 12)was significantly higher than that in the elderly patients (A: 9，B: 9)(Uvalue of A was 304 368.5，P<0.01；Uvalue of B was 302 802.0，P<0.01)；The median of SFCs of bacteriology positive patients (A: 27，B: 20)was significantly higher than that of bacteriology negative patients(A: 10，B: 10)(Uvalue of A was 298 504.0，P<0.01；Uvalue of B was 279 815.5，P<0.01)；The median of SFCs of patients with cavity in lung(A: 32，B: 25) is higher than that in patients with no cavity in lung(A: 10，B: 9)(Uvalue of A was 208 015.5，P<0.01；Uvalue of B was 216 424.5，P<0.01)；The median of SFCs of patients with higher mononuclear cells (A: 21，B: 20)was significantly higher than that in patients with normal mononuclear cells(A: 10，B: 9)(Uvalue of A was 308 522.0，P<0.01；Uvalue of B was 307 748.0，P<0.01). Conclusion SFCs of T-SPOT.TB cannot be related with tuberculosis activity, but the trends of more high tuberculosis activity level accompany with more SFCs can be found.

Latent tuberculosis/diagnosis； Enzyme-linked immunospot assay

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.013

沈陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目(F12-255-1-00)

110044 沈陽市胸科醫(yī)院結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室

孫炳奇，Email：Sunbq2004@163.com

2015-02-11)