張 米，尹天泉，馮華松

抗腫瘤樹突狀細(xì)胞疫苗研究進(jìn)展

張 米，尹天泉，馮華松

免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的殺傷作用主要通過細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，而樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是體內(nèi)唯一能夠激活初始細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞，在機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)中起到重要的橋梁作用。抗腫瘤DCs疫苗旨在通過激活DCs功能進(jìn)而激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，是近年來腫瘤免疫治療中的研究熱點(diǎn)。作者就抗腫瘤DCs疫苗的研究進(jìn)展作一綜述。

樹突狀細(xì)胞；腫瘤；疫苗；免疫治療

近年來，腫瘤免疫治療受到了廣泛關(guān)注并取得良好進(jìn)展，抗腫瘤樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)疫苗是其中的研究熱點(diǎn)之一[1-3]。作者從DCs的發(fā)現(xiàn)與生物學(xué)特征、擴(kuò)增方法以及誘導(dǎo)DCs疫苗成熟的方法、DCs疫苗的負(fù)載方法、給藥途徑、研發(fā)存在的問題及應(yīng)用前景6個(gè)方面進(jìn)行綜述。

1 DCs的發(fā)現(xiàn)與生物學(xué)特征

1973年，Steinman和Cohn[4]在體外培養(yǎng)小鼠脾細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)了一群形態(tài)呈樹枝狀的細(xì)胞，因此命名為DCs。此后，Steinman在對(duì)其功能的研究中發(fā)現(xiàn)DCs是混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction，MLR)最有力的刺激因素，并推斷DCs是激活T、B淋巴細(xì)胞活化的“輔助”細(xì)胞[5]。這一推斷在后來的研究中得到了充分的證實(shí)。目前認(rèn)為，DCs是體內(nèi)抗原提呈能力最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞，也是唯一能夠激活初始T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)反應(yīng)的細(xì)胞[6-7]。DCs無特異性表面標(biāo)志物，F(xiàn)ms樣酪氨酸激酶3受體是其共同表面標(biāo)志物，小鼠DCs的相對(duì)特異性標(biāo)志物為NLDC145、33D1，人DCs的相對(duì)特異性標(biāo)志物為CD1a、CD11c、CD83和血液樹突狀細(xì)胞抗原2。目前已發(fā)現(xiàn)的DCs膜表面分子主要有：①吞噬相關(guān)受體包括FcγR、FcεR、Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)、補(bǔ)體受體、甘露糖受體；②抗原提呈分子包括組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ/Ⅱ類分子、CD1分子；③共刺激分子為CD80、CD86；④黏附分子為CD40、CD54、β1/β2整合素家族等；⑤細(xì)胞因子受體為粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體(granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor，GM-CSFR)、白介素-1受體(interleukin-1 receptor，IL-1R)、IL-10R、IL-4R[8]。

DCs起源于骨髓髓樣干細(xì)胞和淋巴樣干細(xì)胞，以未成熟DCs(immature dendritic cells，imDCs)狀態(tài)廣泛分布于除腦組織外的全身各組織器官。imDCs高表達(dá)吞噬相關(guān)受體，具有強(qiáng)大的抗原攝取能力，攝取抗原后，向淋巴結(jié)歸巢并逐漸成熟。成熟 DCs (mature dendritic cells，mDCs)喪失抗原攝取能力，高表達(dá)MHCⅠ/Ⅱ類分子，以及CD40、CD80、CD86等共刺激分子和黏附分子，具有強(qiáng)大的抗原提呈能力，在淋巴結(jié)的T細(xì)胞區(qū)將抗原提呈給T細(xì)胞，并分泌細(xì)胞因子，激活初始T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。研究表明，imDCs體外激發(fā)MLR的能力弱，而mDCs激發(fā)MLR的能力強(qiáng)；imDCs誘導(dǎo)免疫耐受，而mDCs激活免疫反應(yīng)[9-10]。基于imDCs與mDCs在功能上的差異，誘導(dǎo)DCs成熟是DCs疫苗制備中的重要環(huán)節(jié)[11]。吞噬腫瘤抗原卻未能分化成熟的DCs疫苗具有誘發(fā)機(jī)體免疫耐受，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

2 DCs的擴(kuò)增方法

DCs數(shù)量很少，在人的外周血中其數(shù)量不足單個(gè)核細(xì)胞的1%，在小鼠的脾臟中僅占細(xì)胞數(shù)的0.2%～0.5%。DCs的穩(wěn)定擴(kuò)增是DCs疫苗制備的前提條件。因而，很多研究致力于DCs培養(yǎng)方法的探索及不同方法間的比較。目前，已經(jīng)形成了較為成熟的DCs擴(kuò)增方法，可供實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用。

2.1 人DCs的擴(kuò)增方法 人DCs的擴(kuò)增多采用外周血來源的單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)[12-14]。PBMCs易于分離，在 GM-CSF和IL-4的作用下，培養(yǎng)5～7 d轉(zhuǎn)化為DCs。每10 mL血可培養(yǎng)出(0.5～2)×106個(gè)DCs，其中95%～99%細(xì)胞呈CD1a+CD14-CD83lo/-表現(xiàn)。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過8 d時(shí)，DCs會(huì)自發(fā)成熟，伴隨CD83上調(diào)。目前，人DCs的培養(yǎng)技術(shù)已比較成熟，其數(shù)量和質(zhì)量均可滿足臨床應(yīng)用。

2.2 小鼠DCs的擴(kuò)增方法 自1992年Inaba等[15]報(bào)道大量擴(kuò)增DCs的方法以來，DCs的培養(yǎng)方法已歷經(jīng)多次改良。由于用小鼠PBMCs培養(yǎng)DCs所獲得的細(xì)胞數(shù)量較少(約1×105個(gè)/只)，小鼠DCs的體外擴(kuò)增多采用骨髓來源的前體細(xì)胞，在GM-CSF和IL-4的作用下轉(zhuǎn)化為DCs，但各實(shí)驗(yàn)室所采取的濃度及培養(yǎng)時(shí)間有所差異[15-18]。一般采用8～12周齡的小鼠，可培養(yǎng)出足夠數(shù)量的DCs(約5×106個(gè)/只)。此外，還有學(xué)者嘗試應(yīng)用Fms樣酪氨酸激酶3配體在體內(nèi)擴(kuò)增DCs，實(shí)驗(yàn)證明該方法可有效擴(kuò)增DCs數(shù)目至20倍左右[19]。但DCs的體內(nèi)擴(kuò)增可控性較差，目前技術(shù)手段仍欠成熟，實(shí)驗(yàn)中多數(shù)采用體外擴(kuò)增培養(yǎng)的方法。

3 DCs疫苗的負(fù)載方法

DCs是免疫系統(tǒng)對(duì)抗腫瘤的始動(dòng)環(huán)節(jié)，因而許多學(xué)者試圖通過激活DCs對(duì)腫瘤抗原的吞噬、提呈功能來激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。而如何使DCs吞噬目的抗原，即負(fù)載DCs，是制備DCs疫苗的首要步驟。目前，已研發(fā)出多種DCs疫苗負(fù)載方法，不同方法負(fù)載的DCs疫苗所誘導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)強(qiáng)弱不等，并有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

3.1 腫瘤抗原肽負(fù)載的DCs疫苗 腫瘤抗原肽沖擊負(fù)載的DCs疫苗有較大的選擇性，不易產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)。但大多數(shù)MHC限制性腫瘤抗原肽的半衰期僅2～10 h；若要誘導(dǎo)出高水平持久的抗腫瘤免疫效應(yīng)，則要反復(fù)多次回輸負(fù)載腫瘤抗原多肽的DCs。有研究發(fā)現(xiàn)，卵清蛋白可作為輔助蛋白用于腫瘤抗原肽負(fù)載DCs疫苗的制備，其治療效果明顯優(yōu)于對(duì)照組[20]。

3.2 全細(xì)胞抗原負(fù)載的DCs疫苗 全細(xì)胞抗原負(fù)載DCs是目前廣泛采用的方法，用反復(fù)凍融、超聲破碎、放射線照射等方法獲得腫瘤細(xì)胞裂解物，直接負(fù)載DCs。它包括了所有已知、未知的腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigens，TAAs)和腫瘤特異性抗原(tumor specific antigens，TSAs)，不需要鑒定分離腫瘤TAAs或TSAs，制備方法簡(jiǎn)便。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，凍融的腫瘤細(xì)胞可在體外致敏DCs[21-22]。還有學(xué)者嘗試氬氦冷凍消融術(shù)后瘤體內(nèi)注射DCs，從而在體內(nèi)負(fù)載DCs疫苗，實(shí)驗(yàn)表明該方法可降低腫瘤的復(fù)發(fā)率、延長生存時(shí)間[18，23]。目前，已報(bào)道的用于DCs疫苗研究的腫瘤模型多樣，包括Lewis肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌，均獲得了良好的治療效果[24-29]。說明DCs疫苗應(yīng)用范圍較廣，無明顯的腫瘤組織類型特異性。

3.3 基因修飾的DCs疫苗 腫瘤抗原基因轉(zhuǎn)染的DCs疫苗可使DCs持續(xù)以合適的方式將腫瘤抗原的表位與MHC結(jié)合，表達(dá)于DCs的表面，從而更有效地激活T細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)[30]。但目前僅有少數(shù)幾種腫瘤如黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌鑒定了能被T細(xì)胞表位識(shí)別的腫瘤抗原決定簇，多數(shù)腫瘤缺乏明確的TSAs、TAAs。因此，用已知少數(shù)的幾種特異抗原轉(zhuǎn)染DCs治療腫瘤，其應(yīng)用范圍較??；當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生突變而喪失其特異抗原時(shí)，這種單一腫瘤抗原負(fù)載的免疫細(xì)胞將無法有效識(shí)別，而且可能產(chǎn)生與宿主細(xì)胞基因組整合的危險(xiǎn)。用利于向輔助性T細(xì)胞1方向極化的細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染DCs細(xì)胞，可有效地激活 CTL反應(yīng)。已有研究表明，將IL-7、IL-12、IL-18、腫瘤壞死因子-α細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染DCs可提高激活抗腫瘤特異性T細(xì)胞的能力[31-32]。

3.4 腫瘤細(xì)胞與DCs融合 與腫瘤細(xì)胞融合后的DCs可表達(dá)全部TAAs和TSAs，有關(guān)實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞融合疫苗可有效刺激CD4+T、CD8+T細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)，對(duì)原發(fā)瘤及轉(zhuǎn)移瘤均可產(chǎn)生有效的抑制作用[33-34]。

3.5 熱休克蛋白負(fù)載的DCs疫苗 從腫瘤組織中純化的熱休克蛋白結(jié)合了多種腫瘤細(xì)胞特有的抗原肽，可通過DCs表面的受體直接使伴侶分子抗原肽經(jīng)MHCⅠ類分子提呈，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤特異的多個(gè)和多種CTL克隆(αβCTL和γδCTL)，殺傷腫瘤細(xì)胞，但其提取、純化過程復(fù)雜，限制了它們的臨床應(yīng)用[35-36]。

4 誘導(dǎo)DCs疫苗成熟的方法

DCs的成熟是DCs疫苗制備中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。表達(dá)于DCs表面的TLR，主要識(shí)別脂多糖等病原體保守結(jié)構(gòu)。TLR結(jié)合配體后，通過髓樣化因子88、核因子-κB多條信號(hào)途徑，啟動(dòng)細(xì)胞活化進(jìn)程，上調(diào)主要MHC、CD80、CD86等共刺激分子表達(dá)，分泌腫瘤壞死因子、IL-6迅速激活天然免疫系統(tǒng)。TLR的主要配體包括G-菌的脂多糖、類脂A、革蘭陽性菌的肽聚糖、脂磷壁酸、脂阿拉伯甘露聚糖、疏密螺旋體的脂蛋白、酵母多糖和細(xì)菌DNA、非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸的寡脫氧核苷酸，是促進(jìn)DCs成熟的高效刺激物。研究中應(yīng)用較多的免疫佐劑為卡介苗細(xì)胞壁骨骼、脂多糖和非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸的寡脫氧核苷酸，實(shí)驗(yàn)表明這些免疫佐劑可有效刺激DCs疫苗的成熟，增強(qiáng)疫苗的抗腫瘤作用[37-38]。此外，還有學(xué)者嘗試用γ-干擾素誘導(dǎo)出半成熟狀態(tài)的DCs，這樣DCs既保留了吞噬抗原的能力，也可在吞噬抗原后分化成熟[39]。成熟的DCs高表達(dá)MHCⅠ/Ⅱ類分子、CD80、CD86、CD40及黏附分子。目前，疫苗制備中多采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD80、CD86的表達(dá)來鑒別DCs的成熟度。

5 DCs疫苗的給藥途徑

DCs疫苗的給藥途徑主要包括靜脈注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、瘤體內(nèi)注射方法。其中，皮下注射治療組治療效果優(yōu)于靜脈注射組，肝、脾的破壞是導(dǎo)致靜脈注射治療效果欠佳的主要原因；而歸巢率較低是制約皮下和皮內(nèi)注射組治療效果重要因素；瘤體內(nèi)注射法難度相對(duì)較大，具體操作方法、作用機(jī)制還有待更加深入地研究[40]。

6 DCs疫苗存在的問題

理想的抗腫瘤DCs疫苗制備方法應(yīng)具備：①能夠擴(kuò)增數(shù)量足夠并具有良好活性的DCs；②在攝取抗原前應(yīng)維持DCs的未成熟狀態(tài)；③在吞噬抗原后應(yīng)確保DCs分化成熟；④回輸體內(nèi)的DCs能夠順利歸巢，激活初始CTL反應(yīng)，誘導(dǎo)抗腫瘤特異性免疫反應(yīng)；⑤具有較長效的抗腫瘤作用；⑥避免誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)。目前，DCs疫苗的研發(fā)依然存在一些問題：DCs的擴(kuò)增在數(shù)量上基本能夠滿足實(shí)驗(yàn)及臨床需要，但不同方法擴(kuò)增的DCs在疫苗制備中是否存在差異，還需進(jìn)一步比較；由于imDC與mDC在功能上存在很大差異，為充分發(fā)揮其抗原攝取與提呈的雙重功能，刺激DCs成熟的合適時(shí)機(jī)尚需進(jìn)一步探討；DCs在體內(nèi)的歸巢率低，是制約DCs疫苗治療效果重要因素，如何提高DCs疫苗的歸巢率，是DCs疫苗研發(fā)過程中必須攻克的一大難題。

7 DCs疫苗的應(yīng)用前景

目前，DCs疫苗的抗腫瘤作用已在多種腫瘤動(dòng)物模型上得以證實(shí)。研究表明，DCs疫苗可誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞1型免疫反應(yīng)，有效刺激腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞增殖，可使腫瘤體積縮小或消失，降低腫瘤復(fù)發(fā)率，延長動(dòng)物生存時(shí)間[41]。臨床試驗(yàn)證實(shí)，DCs疫苗具有良好的相容性，是安全、可行的治療方法[42]。這些結(jié)果彰顯了其良好的臨床應(yīng)用前景。雖然目前抗腫瘤DCs疫苗尚未取得令人滿意的臨床治療效果，但其研發(fā)為腫瘤的治療帶來了新的方法，為腫瘤患者帶來了新的希望。未來研究中，對(duì)上述DCs疫苗存在問題的解決，必將為其廣泛的臨床應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，推動(dòng)腫瘤治療的發(fā)展。

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Advance in anti-tumor dendritic cell vaccines

ZHANG Mi1，YIN Tianquan2，F(xiàn)ENG Huasong3
(1.Medical School of Chinese PLA，Beijing 100853，China；2.Department of Emergency，Beijing Chaoyang Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100020，China；3.Department of Respiratory Medicine，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

Cytotoxic T lymphocytes(CTL)are the main effector cells in the anti-tumor immune response.Dendritic cells(DCs)，which are considered to be the most potent antigen presenting cells(APC)in the body，are the only cells that can activate cytotoxic T lymphocytes and thus play an important role in the anti-tumor immunity.Research in DCs-based vaccines has evoked great interest and made much progress in recent years.Advance in anti-tumor DCs vaccines is to be reviewed here.

Dendritic cells(DCs)；Tumor；Vaccines；Immunotherapy

R730.51

A

2095-3097(2015)06-0365-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.06.013

2015-06-14 本文編輯：張?jiān)谖?

100853北京，解放軍醫(yī)學(xué)院(張 米)；100020北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院急診科(尹天泉)；100048北京，海軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科(馮華松)

馮華松，E-mail：fenghs99＠163.com