Y染色體微缺失對(duì)IVF/ICSI-ETSI-ET妊娠結(jié)局及后代出生缺陷的影響*

王麗霞孫寶剛房 姣 曹井賀 粱魯南 張 寧 楊愛軍

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（濟(jì)寧 272000）

Y染色體微缺失對(duì)IVF/ICSI-ETSI-ET妊娠結(jié)局及后代出生缺陷的影響*

王麗霞△孫寶剛△房 姣 曹井賀 粱魯南 張 寧 楊愛軍

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（濟(jì)寧 272000）

摘要目的 通過分析少精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者的Y染色體微缺失情況及其體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射（IVF/ICSI-ET）妊娠結(jié)局以及后代情況，探討AZF微缺失對(duì)輔助生殖妊娠結(jié)局以及出生后代的影響。方法 實(shí)驗(yàn)組中488例少精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者行Y染色體微缺失檢測(cè)，將缺失攜帶者作為A組，將非攜帶患者作為B組。有正常生育能力，并有自然生育史的125例男性納入對(duì)照組（C組）。對(duì)比A組、B組以及C組的妊娠結(jié)局和出生后代指標(biāo)差異。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組中488例少精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者中，Y染色體微缺失者共56例，均為AZFc微缺失，其中14例（25%）表現(xiàn)為少精子癥，42例（75%）表現(xiàn)為嚴(yán)重少精子癥。A組、B組和C組妊娠結(jié)局以及對(duì)子代影響的指標(biāo)，3組間兩兩比較后均顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 Y染色體微缺失對(duì)IVF/ICSI-ET治療周期形成的妊娠結(jié)局以及出生后代無顯著性影響。

關(guān)鍵詞Y染色體微缺失; 男性不育; IVF/ICSI-ET; 妊娠結(jié)局

目前關(guān)于無精子基因（azoospermia factor, AZF）的研究主要集中在AZF微缺失與精子發(fā)生障礙的關(guān)系等方面，而AZF微缺失對(duì)IVF/ICSI-ET(in vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection and embryo transplantation，體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植)妊娠結(jié)局以及對(duì)出生后代的影響鮮有報(bào)道?；谝陨涎芯勘尘?，我們通過分析少精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者的AZF微缺失情況及其IVF/ICSI-ET妊娠結(jié)局及對(duì)后代的影響，為臨床上對(duì)此類患者進(jìn)行治療措施的選擇、遺傳咨詢和妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)等提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集在我院生殖醫(yī)學(xué)科就診的488例不孕不育男性患者，其中280例少精子癥患者，208例嚴(yán)重少精子癥患者。AZF微缺失者作為A組，無AZF微缺失者作為B組，以上兩組為實(shí)驗(yàn)組。有正常生育能力，并有自然生育史的因女方輸卵管因素就診的男性（C組）納入對(duì)照組。以上所有的研究對(duì)象均在自愿的前提下簽署了知情同意書。

男性不育患者標(biāo)準(zhǔn)：精子濃度＜15×106/mL，總活力前向運(yùn)動(dòng)精子（PR）+非前向運(yùn)動(dòng)精子（NP）＜40%或PR＜32%；精子總數(shù)＜39×106/次；正常形態(tài)率＜4%， 精子濃度＜5×106/mL者為嚴(yán)重少精子癥。排除染色體異常、免疫異常和感染等已知影響妊娠結(jié)局的因素，排除采用AID（intrauterine insemination with donor semen，供精人工授精）治療患者。

女方篩選標(biāo)準(zhǔn)：染色體核型正常46, XX， 未發(fā)現(xiàn)已知的影響IVF-ET或ICSI-ET妊娠結(jié)局的疾病，[均通過子宮輸卵管造影（hysterosalpinography, HSG）或者宮腔鏡、腹腔鏡手術(shù)以及超聲檢查證實(shí)]。

二、方法

（一）實(shí)驗(yàn)方法

1. 多重聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)方法：用血液DNA 提取試劑盒提取DNA，運(yùn)用多重PCR 技術(shù)檢測(cè)Y染色體AZF基因家族AZFa、AZFb、AZFc 3個(gè)區(qū)域中的6個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)微缺失。每個(gè)樣品做A組和B組兩個(gè)多重PCR反應(yīng)， A 組包括sY254、sY127、sY86 3個(gè)位點(diǎn)；B組包括sY134、sY84、sY255 3個(gè)位點(diǎn)。每組設(shè)置一對(duì)擴(kuò)增SRY 基因（位于Y染色體短臂上的性別決定基因）的引物， 作為內(nèi)對(duì)照。Y染色體微缺失試劑盒來自于上海透景生命科技有限公司。按照試劑盒操作說明擴(kuò)增DNA， 擴(kuò)增條件為: 95℃ 3min； 95℃30s， 59℃ 30s， 72℃ 30s， 35個(gè)循環(huán)， 最后72℃ 延伸10min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后， 用凝膠成像系統(tǒng)觀察分析條帶。

2. 精液常規(guī)分析：（1）計(jì)算機(jī)輔助精子分析（CASA） 采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀(西班牙，SCA)檢測(cè)精子密度、總數(shù)、各級(jí)運(yùn)動(dòng)精子百分率和數(shù)量等；（2）精子形態(tài)學(xué)分析（Diff-Quik法） 檢測(cè)精子形態(tài)正常率=形態(tài)正常精子數(shù)/計(jì)數(shù)精子總數(shù)× 100%。

（二）遺傳咨詢

對(duì)所有Y 染色體微缺失檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的患者均進(jìn)行系統(tǒng)的遺傳咨詢，告知：如果選擇ICSI 治療，男性后代難以避免將再次面臨同樣的Y 染色體微缺失導(dǎo)致的生育問題； 另外的選擇，包括PGD （preimplantation genetic diagnosis，種植前基因診斷）進(jìn)行醫(yī)療性性別選擇或供精人工授精。

（三）臨床操作

1. 控制性超促排卵：A組與B組和C組女方均選擇長(zhǎng)方案超促排卵：于啟周期前次月經(jīng)黃體中期肌注達(dá)菲林（天津-益普生公司, 3.75mg）3.75mg，月經(jīng)第3天開始使用促性腺激素（Gn）促排卵[果納芬,默克雪蘭諾, 5.5 μg (75 IU)]，月經(jīng)第6天起，行陰道B超檢查卵泡和子宮內(nèi)膜發(fā)育情況，并以此及時(shí)調(diào)整用藥。直至有2～3個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑在18mm以上時(shí)，結(jié)合激素檢測(cè)結(jié)果提示卵泡發(fā)育成熟，停用促排卵藥物，于當(dāng)晚8點(diǎn)注射人絨毛膜促性腺激素（hCG）5 000～10 000u。注射hCG后34～36h在陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵，記錄取卵數(shù)。

2. 受精及胚胎培養(yǎng)：B組采用常規(guī)的體外受精：受精后18h觀察原核，出現(xiàn)2個(gè)原核和2個(gè)極體為正常受精卵，未出現(xiàn)2PN為受精完全失敗。取卵后培養(yǎng)72h觀察胚胎形態(tài)，將優(yōu)質(zhì)胚胎移植到宮腔內(nèi)。胚胎移植后14d檢測(cè)尿或血hCG陽(yáng)性，移植后4～5周超聲檢查見胎心搏動(dòng)為臨床妊娠。移植時(shí)先選擇常規(guī)受精來源的胚胎，若無常規(guī)受精來源胚胎則移植ICSI受精胚胎。

3. 胚胎按以下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：形態(tài)學(xué)指標(biāo) 4’-卵裂球大小均勻，碎片為≤5%；3’-卵裂球大小均勻或不等，碎片6%～20%；2’-卵裂球體積相等或不等，碎片21%～50%；1’-卵裂球少，碎片＞50%。1、2級(jí)胚胎在發(fā)育過程中出現(xiàn)下列情況，胚胎評(píng)級(jí)時(shí)在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上降一級(jí)：（1）授精20h內(nèi)未見到原核，48h證實(shí)為延遲受精的胚胎。（2）取卵后48h超過8細(xì)胞或72h未超過5細(xì)胞。正常受精4、3級(jí)胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。

（三）計(jì)算公式

受精率=正常受精卵數(shù)/卵-冠-丘復(fù)合體數(shù)× l00%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵數(shù)× l00%；臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/移植周期數(shù)× l00%；生化妊娠率= 生化妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)；流產(chǎn)率= 孕28周前流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)； 早產(chǎn)率= ART受試者在妊娠滿28周至不滿37周期間分娩周期數(shù)/分娩周期數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用x±s表示，比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料用率（比值）表示，比較應(yīng)用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

488例少精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者中，Y染色體AZF微缺失者共56例，均為AZFc微缺失。其中14例（25%）表現(xiàn)為少精子癥，42例（75%）表現(xiàn)為嚴(yán)重少精子癥。

一、AZFAZF微缺失與未見AZFAZF微缺失一般資料比較

比較A組與B組和C組患者：男、女方年齡、不孕年限、精液量、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。精液參數(shù)中，精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子率（PR）、正常形態(tài)率、精子存活率、C組高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，非前向運(yùn)動(dòng)精子率（NPR）A組和B組高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而A組與B組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

二、AZFAZF微缺失與未見AZFAZF微缺失與IVF-ETVF-ET或ICSI-ETSI-ET妊娠結(jié)局的比較

A組、B組以及C組受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、著床率、生化妊娠率、臨床妊娠率指標(biāo)兩兩比較后顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

三、AZFAZF微缺失對(duì)子代影響

A組和B組有Y染色體AZF微缺失56例患者。19者成功妊娠并分娩，其中男嬰為11例。我們對(duì)其中8例男性后代行AZF微缺失檢測(cè)，均發(fā)現(xiàn)為AZFc缺失，其中A組、B組以及C組流產(chǎn)率、早產(chǎn)率、后代出生體重、雙胎妊娠率、男嬰比例、出生缺陷率兩兩比較后顯示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表3。

討 論

AZF最早于1976年被國(guó)外學(xué)者[1]發(fā)現(xiàn)，Y染色體長(zhǎng)臂遠(yuǎn)端（Yq11）存在著控制精子發(fā)生的基因，并把這一區(qū)域稱作AZF；1992年Vollrath等[2]發(fā)表了Y染色體圖譜并借助特異性序列標(biāo)簽位點(diǎn)（STS）將Y染色體分為7區(qū)43亞區(qū)；1996年Voget[3]將AZF分為AZFa、AZFb、AZFc無重疊的3個(gè)區(qū)域。我們選取了AZF區(qū)的常見缺失基因?qū)?yán)重少弱精子或無精子患者進(jìn)行常規(guī)篩查，這也是目前國(guó)內(nèi)外診治男性不育的共識(shí)[4, 5]。現(xiàn)在已經(jīng)有大量的研究證實(shí)AZF缺失是一些嚴(yán)重少弱精子癥和無精子癥患者生精功能障礙的重要原因。AZF微缺失是男性不育的重要遺傳學(xué)因素，其分子遺傳學(xué)檢測(cè)是臨床常用的男性不育診斷指標(biāo)之一。AZFc 區(qū)缺失， 臨床表現(xiàn)多樣化， 可以為正常精液、少精子或無精子的表現(xiàn)。我們研究也發(fā)現(xiàn)488例少精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者中，Y染色體AZF微缺失者共56例，均為AZFc微缺失。其中14例（%）表現(xiàn)為少精子癥，42例（%）表現(xiàn)為嚴(yán)重少精子癥。

AZF缺失對(duì)IVF/ICSI-ET治療結(jié)局，目前鮮有報(bào)道，且結(jié)果存在爭(zhēng)議。van Golde等[6]研究Y染色體微缺失與無Y染色體微缺失ICSI治療者比較，受精率、胚胎質(zhì)量明顯低于對(duì)照組，但胚胎種植率和活產(chǎn)率與對(duì)照組無明顯差異，提示Y染色體AZFc微缺失影響ICSI治療的受精率和胚胎質(zhì)量。同樣，Patrat等[7]、Kihaile等[8]、Choi等[9]及Guo等[10]的研究發(fā)現(xiàn)Y染色體微缺失的無精子癥和嚴(yán)重少弱精子癥患者行ICSI的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎形成率、囊胚形成率及妊娠率與年齡、常規(guī)精液參數(shù)匹配的無Y染色體微缺失的對(duì)照組相似。而Dewan[11]和Karaer[12]研究發(fā)現(xiàn)Y染色體的完整性在胚胎發(fā)育和維持妊娠中發(fā)揮著重要作用，而研究產(chǎn)生不一致的原因可能與選擇的 STS 不同或與人種的差異有關(guān)。本研究通過分析AZF微缺失與無缺失的少精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者的IVF/ ICSI-ET妊娠結(jié)局，探討AZF微缺失對(duì)輔助生殖妊娠結(jié)局的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：AZF微缺失的攜帶者在接受IVF-ET或ICSI-ET治療后，其受精率、著床率和臨床妊娠率與AZF無缺失者相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示Y染色體AZFc微缺失對(duì)輔助生育妊娠結(jié)局無不利影響。這與我們?cè)缙诘难芯肯嘁恢耓13]，我們對(duì)109例妻子不明原因流產(chǎn)男性患者進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：109例反復(fù)流產(chǎn)夫婦中Y染色體異常28例。Y染色體結(jié)構(gòu)異常18例，數(shù)目異常2例，多態(tài)性變異8例。未發(fā)現(xiàn)存在Y染色體缺失的病例。

由于AZF微缺失多導(dǎo)致嚴(yán)重生精障礙，自然狀態(tài)下難以使女方受孕生育子代，故在人群中發(fā)生父子間自然垂直遺傳的幾率罕見。而應(yīng)用IVF/ICSI-ET技術(shù)則可以增加人群中發(fā)生父子間自然垂直遺傳的幾率。Oates等[14]分析了 AZFc微缺失攜帶者的臨床指標(biāo)和妊娠結(jié)局，發(fā)現(xiàn)AZFc微缺失的男性無明顯軀體異常，精子發(fā)生比較穩(wěn)定，一般通過射精或TESE可以獲得活動(dòng)精子。在他們的報(bào)道中，經(jīng)過ICSI-ET治療42.8%的AZFc微缺失攜帶者成功妊娠，其中男孩比例為55.5%，本研究中Y染色體AZF微缺失56例患者。19例患者成功妊娠并分娩，未發(fā)現(xiàn)有胎兒畸形，其他指標(biāo)諸如流產(chǎn)率、早產(chǎn)率、后代出生體重、雙胎妊娠率、男嬰比例、與無AZF微缺失比較未發(fā)現(xiàn)差異有相關(guān)性。而通過IVF/CSI-ET技術(shù)出生的8位男性后代行AZF微缺失檢測(cè)，均發(fā)現(xiàn)為AZFc缺失。由此可知AZFc微缺失的臨床效應(yīng)主要是精子質(zhì)量的下降，AZFc微缺失對(duì)胚胎發(fā)育、機(jī)體代謝和男性子代一般軀體的影響不明顯。AZFc微缺失可以由父親遺傳給男性子代，缺失片段的長(zhǎng)度和類型基本一致，但是成年后同樣會(huì)有精子發(fā)生障礙和不育的風(fēng)險(xiǎn)。因此對(duì)AZF微缺失攜帶者提供生育前的遺傳咨詢非常必要。應(yīng)當(dāng)通過PGD盡量選擇女胚移植或改行AID進(jìn)行治療，切斷遺傳途徑，以達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的。

綜上所述， Y染色體微缺失對(duì)治療周期形成的胚胎情況、妊娠結(jié)局以及出生子代無顯著性影響。通過對(duì)AZF微缺失的研究，可以對(duì)IVF/ICSI-ET妊娠結(jié)局的影響做進(jìn)一步了解，對(duì)患者的生育力進(jìn)行合理評(píng)估，同時(shí)可以對(duì)Y 染色體微缺失檢測(cè)患者進(jìn)行更為系統(tǒng)的遺傳咨詢。由于AZF微缺失往往涉及多個(gè)基因，單個(gè)AZF相關(guān)基因的臨床意義很難從AZF微缺失的臨床表現(xiàn)上進(jìn)行推斷。因此對(duì)AZF微缺失的分子遺傳學(xué)研究依然任重道遠(yuǎn)。

參 考 文 獻(xiàn)

1 Tiepolo L, Zufardi O. Location of factors controlling spermatogenesisin the nonfluorescent portion of the human Y chomosome long arm. Hum Genet 1976; 34 (2): 119-124

2 Vollrath D, Foote S, Hilton A, et al. The human Y chromosome: a 43-interval map based on naturally occurring deletions. Science 1992; 258 (5079): 52-59

3 Vogt PH , Edelmann A , Kirsch S, et al. Human Y chromosome azoospermia factors ( AZF) mapped to different subregions in Yq11. Hum Mol Genet 1996; 5(7): 933-943

4 Stahl PJ, Masson P, Mielnik A, et al. A decade of experience emphasizes that testing for Y microdeletions is essential in Americanmen with azoospermia and severe oligozoospermia. Fertil Steril 2010; 94(5): 1753-1756

5 韓瀟, 劉睿智. Y染色體微缺失與男性不育. 中國(guó)生育健康雜志 2007; 18(3): 183-185, 189

6 van Golde RJ, Wetzels AM, de Graaf R, et al. Decreased fertilization rate and embryo quality after ICSI in oligozoospermic menwith microdeletions in the azoospermia factor c region of the Ychromosome. Hum Reprod 2001; 16(2): 289-292

7 Patrat C, Bienvenu T, Janny L, et al. Clinical data and parenthood of 63 infertile and Y-microdeleted men. Fertil Steril 2010; 93(3): 822-832

8 Kihaile PE, Kisanga RE, Aoki K, et al. Embryo outcome in Ychromosome microdeleted infertile males after ICSI. Mol Reprod 2004; 68(2): 176-181

9 Choi JM, Chung P, Veeck L, et al. AZF microdeletions of the Ychromosome and in vitro fertilization outcome. Fertil Steril 2004; 81(2): 337-341

10 Guo T, Qin Y, Gao X, et al. The role of male chromosomal polymorphism played in spermatogenesis and the outcome of IVF/ICSI-ET treatment. Int J Androl 2012; 35(6): 802-809

11 Dewan S, Puscheck EE, Coulam CB, et al. Y-chromosome microdeletions and recurrent pregnancy loss. Fertil Steril 2006; 85(2): 441-445

12 Karaer A, Karaer K, Ozaksit G, et al. Y chromosome azoosper-mia factor region microdeletions and recurrent pregnancy loss. Am J Obstet Gynecol 2008; 199(6): 662. e1-5

13 孫寶剛, 曹井賀, 粱魯南, 等. Y染色體異常與反復(fù)流產(chǎn)關(guān)系的初探. 中國(guó)男科學(xué)雜志 2013; 27(3): 54-56

14 Oates RD, Silber S, Brown LG, et al. Clinical characterization of 42 oligospermic or azoospermic men with microdeletion of the AZFc region of the Y chromosome, and of 18 children conceived via ICSI. Hum Reprod 2002; 17(11): 2813-2824

（2014-10-24收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.04.003

中圖分類號(hào)R 698.2

*基金項(xiàng)目資助：濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院苗圃科研項(xiàng)目[JYFY-MP-2013-(ZD)-005]△為共同第一作者

The role of AZF microdeletion played in the outcome of IVF/ICSI-ET treatment*

Wang Lixia△, Sun Baogang△, Fang Jiao, Cao Jingheng, Liang Lunan, Zhang Ning, Yang Aijun
Affi liated Hospital of Jining Medical College, Jining, Shangdong 272000, China

AbstractObjective To evaluate the role of AZF microdeletion in spermatogenesis and its impact on IVF /ICSIET outcome. Methodsthods A retrospective analysis was conducted in 488 infertile couples requesting IVF or ICSI treatments. All the males were oligozoospermia or severe oligozoospermia. Multiplex polymerase chain reaction(M-PCR) was used to identify the microdeletions in AZF regions. 125 men with normal fertility and the natural history of fertility were set as the control group. The outcomes of IVF/ICSI-ET treatment were compared between the experience group with severe oligozoospermia or azoospermia and the control group(Group C). Resultssults Among the 488 males with oligozoospermia or severe oligozoospermia, 14 (25%) with oligozoospermia and 42 (75%) with severe oligozoospermia were found to have microdeletion in AZFc. There were signifi cant differences in the sperm functional parameters between the experimental group and the control group, but no significant difference between the AZF microdeletion carriers (Group A) and noncarriers(Group B).There was also no signifi cant difference in effect of pregnancy outcome and offsping among three groups. Conclusionusion The microdeletions in AZFc regions have not adverse effect on the outcome of ICSI-ET treatment for infertile males with oligozoospermia or severe oligozoospermia.

Key wordsords AZF microdeletion; male infertility; IVF/ICSI-ET; clinical outcome