曲環(huán) 李美紅 陳琛

HGF對(duì)心肌細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的機(jī)制研究

曲環(huán) 李美紅 陳琛

目的分析肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)對(duì)于心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用機(jī)制。方法分離培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞, 將培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞饑餓處理8 h后, 采用流式細(xì)胞儀觀察HGF減少過氧化氫(H2O2)引起的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用, 計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率；采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白FOXO3a變化；并觀察使用lipofectamin2000 轉(zhuǎn)染技術(shù)敲除FOXO3a基因后, HGF對(duì)H2O2引起心肌細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的變化。結(jié)果與對(duì)照組相比, 研究組HGF可以顯著減少, H2O2處理引起的心肌細(xì)胞凋亡, 檢測(cè)顯示心肌細(xì)胞內(nèi)FOXO3a含量基本無變化, 磷酸化的FOXO3a的含量隨時(shí)間變化有所增加。而在敲除FOXO3a基因后, HGF抑制心肌細(xì)胞凋亡的能力顯著減低。結(jié)論HGF抑制心肌細(xì)胞凋亡損傷,使心肌細(xì)胞中的FOXO3a磷酸化增加, 提示HGF促進(jìn)FOXO3a的磷酸化可能與其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用相關(guān)。

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；心肌細(xì)胞凋亡；保護(hù)作用

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)具有促血管形成作用, 減少心肌細(xì)胞凋亡作用。實(shí)驗(yàn)證明HGF可抑制心肌肥大中心肌細(xì)胞的凋亡, 通過抗心肌間質(zhì)纖維化作用和抑制心肌細(xì)胞凋亡作用而抑制左室重構(gòu)［1］。HGF的作用機(jī)制可能是通過MAPK中ERK1/ERK2通路、P38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、PI3K/AKT等調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡過程。本試驗(yàn)通過研究HGF對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用機(jī)制, 闡明HGF具體細(xì)胞信號(hào)作用途徑, 心血管疾病的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 新生乳鼠(北京大學(xué)深圳醫(yī)院動(dòng)物中心)；胎牛血清；DMEM培養(yǎng)基；HGF；H2O2；凋亡試劑盒；5-溴脫氧尿嘧啶；一抗；二抗；α-sarcomeric actin。

1.2 方法

1.2.1 心肌細(xì)胞分離培養(yǎng) 分步消化、差速貼壁、化學(xué)抑制法分離純化新生SD大鼠心肌細(xì)胞后代作原代培養(yǎng)；已培養(yǎng)48 h的心肌細(xì)胞饑餓處理8 h后, 分為兩組：對(duì)照組加入終濃度為0.5 mmol/L的H2O2培養(yǎng)4 h, 研究組加入終濃度為0.5 mmol/L的H2O2和40 ng/ml HGF培養(yǎng)4 h。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率 根據(jù)AnnexinVFITC凋亡檢測(cè)試劑盒使用說明, 貼壁的心肌細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后, PBS洗滌2次, 收集1×105個(gè)細(xì)胞, 加入5000 μl L1xBinding buffer重懸細(xì)胞, 再加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl Propidium Iodide(PI)充分混勻, 室溫避光孵育15min, 流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)對(duì)照組和試驗(yàn)組心肌細(xì)胞凋亡率, 每組各檢測(cè)5個(gè)樣本。

1.2.3 Western-bolt法觀察細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白表達(dá) 獲得的各組細(xì)胞分別提取總蛋白, 取適量(約20 μg)蛋白,98℃變性5 min,12％SDS-PAGE分離, 電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。含5％脫脂奶粉緩沖生理鹽水(TBS/T)封閉1 h, 加入一抗(1：1000),4℃過夜, TBS/T洗3次, 加入二抗(1：2000)孵育1 h, TBS/T洗3次, 加入HRP 化學(xué)發(fā)光底物,壓膠片曝光。

1.2.4 使用lipofectamin2000 轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d, 將0.5×105～2×105個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中, 每孔中加入約1 ml無抗生素的培養(yǎng)基, 使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到30％～50％； 取5 μl/孔 Lipofectamine2000,100 μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀釋。輕輕混和后在室溫孵育5 min； 取5 μl FAM-siRNA, 稀釋, 輕輕混和均勻;稀釋的經(jīng)過5 min 的孵育后,與稀釋FAM-siRNA輕輕混和, 室溫靜置20 min, 形成FAM-siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混和物。將FAM-siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混和液,加入含有細(xì)胞及培養(yǎng)液(約含1 ml)的孔中, 輕輕搖晃孔板,使混和；轉(zhuǎn)染6 h后即可檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率：流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 實(shí)施t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(％)表示, 實(shí)施 χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與對(duì)照組相比, 研究組HGF可以顯著減少(P＜0.05), H2O2處理引起的心肌細(xì)胞凋亡, 檢測(cè)顯示心肌細(xì)胞內(nèi)FOXO3a含量基本無變化, 磷酸化的FOXO3a的含量隨時(shí)間變化有所增加, 提示HGF的保護(hù)作用可能與FOXO3a的磷酸化增加有關(guān)。敲除FOXO3a基因后, HGF抑制心肌細(xì)胞凋亡的能力與顯著減低, 進(jìn)一步表明HGF抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能主要通過PI3K/Akt/FOXO3a途徑, 磷酸化心肌細(xì)胞中FOXO3a, 使其活性減低, 從而抑制心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生,而起到對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

3 討論

FOX各家族功能多種多樣, 包括各種轉(zhuǎn)錄因子、參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化及分化過程。作為FOX家族的亞組, FOXO在新陳代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活及對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等生物進(jìn)程中起重要作用。哺乳動(dòng)物FOXO蛋白質(zhì)家族有4個(gè)成員：FOXO1、FOXO3A 、FOXO4和FOXO6。其中FOXO3A在細(xì)胞、組織與胚胎的發(fā)育、體內(nèi)葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)、卵泡的成熟、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、對(duì)DNA的損傷反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用。心臟組織以FOXO3A分布為主, 在心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用［2］?；罨疐OX03A能抑制血管平滑肌增殖, 抑制心肌細(xì)胞增生肥大及抗氧化應(yīng)激等。非磷酸化狀態(tài)的FOXO3A為活性轉(zhuǎn)錄因子, 主要存在心肌細(xì)胞核中, FOXO3A磷酸化后與細(xì)胞核內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合, 由細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移到核外, FOXO3A喪失轉(zhuǎn)錄活性, 其抗細(xì)胞增殖, 抗心肌肥厚等作用均被抑制［3］。研究發(fā)現(xiàn)HGF抑制心肌細(xì)胞凋亡損傷, 使心肌細(xì)胞中的FOXO3A磷酸化增加, 提示HGF促進(jìn)FOXO3A的磷酸化可能與其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用相關(guān)。

［1］劉峰. 高血壓的心臟并發(fā)癥. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志,2002,22(4):11.

［2］姜勇, 羅深秋. 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子基礎(chǔ)與功能調(diào)控. 北京：科學(xué)出版社,2005:74.

［3］曹冬梅, 盧建. 叉頭框(Fox)轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)構(gòu)與功能 . 生命科學(xué),2006,8(10):16.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.05.197

2014-12-01］

518036 北京大學(xué)深圳醫(yī)院心內(nèi)科(曲環(huán) 李美紅),體檢科(陳琛)