艾莉莎

丙型肝炎病毒F蛋白缺失對病毒復(fù)制及感染性的影響

艾莉莎

目的分析丙型肝炎病毒F蛋白缺失對病毒復(fù)制及感染性的影響。方法利用生物化學(xué)試驗(yàn)法進(jìn)行分析, 首先對丙型肝炎病毒RNA的轉(zhuǎn)錄體進(jìn)行制備, 然后根據(jù)培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、PCR技術(shù)、免疫熒光檢測以及復(fù)制感染性檢測等技術(shù)進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn), 對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行記錄。結(jié)果經(jīng)過試驗(yàn)后得出結(jié)果, 利用J6JFH1/△F轉(zhuǎn)染的病毒單邊反應(yīng)明顯減少, 對上清液毒滴度檢測明顯下降。同時(shí)F蛋白缺失型丙型肝炎病毒中翻譯毒蛋白的RNA含量也有所降低, 病毒顆粒的產(chǎn)生顯著下降。但F蛋白缺失型丙型肝炎病毒的核心蛋白二級結(jié)構(gòu)基本沒有發(fā)生變化。結(jié)論F蛋白的缺失對于病毒本身的復(fù)制和感染性并沒有影響, 但也并不確定F蛋白是HCV的副產(chǎn)物。

丙型肝炎病毒；F蛋白；影響

丙型肝炎病毒是導(dǎo)致人體患上丙型肝炎的罪魁禍?zhǔn)? 其屬于黃病毒科, 是在外部具有包膜的單正鏈RNA病毒。早在1974年就已經(jīng)有相關(guān)研究人員發(fā)現(xiàn)了這種病毒, 并在1989年時(shí)確定了該病毒的基因序列, 并成功克隆出丙肝病毒, 并將因其所引發(fā)的疾病正式命名為丙型肝炎。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)告顯示, 每年約有10萬人感染丙型肝炎, 并由此引發(fā)脂肪肝、肝硬化以及肝癌等疾病。目前, 全球約有1.7億人被丙型肝炎所折磨。相關(guān)研究者在對其進(jìn)行研究中發(fā)現(xiàn)了其核心蛋白之一——F蛋白, 并對其進(jìn)行了十余年的研究, 但對該蛋白的主要功能還沒有系統(tǒng)了解［1］。因此, 作者對F蛋白缺失對丙型肝炎病毒的復(fù)制和感染能力的影響進(jìn)行了相關(guān)試驗(yàn), 以期能為相關(guān)工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 異丙基硫代半乳糖甘、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-1-半乳糖苷、NZ胺、酵母提取物、14 mlBD Falcon聚丙烯管、丙型肝炎病毒單克隆抗體9E10、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、胎牛血清、DMEM、Opti-MEM、Alex488羊抗鼠熒光二抗、FITC-羊抗人IgG、RNA抽提試劑、RotorGene3000熒光定量PCR儀、電穿孔儀、PMD18T等。

1.2 方法 在開始試驗(yàn)前, 第一步需要做的是對質(zhì)粒的構(gòu)建和細(xì)胞株的培養(yǎng), 將J6JFH1/△F利用定點(diǎn)突變試劑盒引入5處突變, 分別是nt406T-A、nt433T-A、nt472G-A、nt479G-A(或nt481G-A)以及nt613C-A。第二步是對丙型肝炎病毒RNA轉(zhuǎn)錄體的制備工作。首先是準(zhǔn)備7種質(zhì)粒, 分別是對比質(zhì)粒、原丙型肝炎病毒質(zhì)粒以及5種突變后的丙型肝炎病毒質(zhì)粒, 對其進(jìn)行XbaⅠ線性化處理；然后利用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒對各質(zhì)粒的RNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；再利用飽和苯酚-氯仿-異戊醇溶液對RNA進(jìn)行純化處理。第三步是對實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的培養(yǎng)。將健康細(xì)胞在配置好的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng), 將細(xì)胞在37℃的溫度下進(jìn)行培養(yǎng), 培養(yǎng)環(huán)境中二氧化碳的濃度應(yīng)保持在5％左右。培養(yǎng)液中含有10％的胎牛血清、L-谷氨酰胺2 mmol/L、NEAA0.1 mmol/L、鏈霉素100 g/ml以及青霉素100 U/ml。第四步是對RNA轉(zhuǎn)錄體的轉(zhuǎn)染工作。首先取1000 g胰蛋白酶細(xì)胞, 在離心5 min后, 取下層液體, 利用DEPC_PBS進(jìn)行清洗；二次離心5 min, 取下層液體, 利用Opti-MEM進(jìn)行清洗；三次離心5 min, 去下層液體, 再次利用Opti-MEM進(jìn)行重懸, 并對溶液中的細(xì)胞進(jìn)行技術(shù)。然后將溶液稀釋到1×107個(gè)/ml, 并取出400 μl轉(zhuǎn)移到電擊杯中(電擊杯的規(guī)格為4 mm)。第五步是將病毒RNA的轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)移到電擊杯中, 搖勻, 將電穿孔儀調(diào)整到270V、960 μl、100 Ωm, 僅對電擊杯進(jìn)行一次點(diǎn)擊, 之后迅速將溶液轉(zhuǎn)移到平皿中, 并在平皿中加入10％的胎牛血清培養(yǎng)液, 在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)(培養(yǎng)條件與細(xì)胞培養(yǎng)條件相同)。第六步是在轉(zhuǎn)染3 d后對培養(yǎng)液中的丙型肝炎病毒RNA進(jìn)行定量, 隨機(jī)選擇引物將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 然后利用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量檢測。第七步是進(jìn)行免疫熒光測試。將已經(jīng)轉(zhuǎn)染過的培養(yǎng)細(xì)胞接種到培養(yǎng)板上(規(guī)格為96孔), 然后再放于一定條件環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)(條件與細(xì)胞培養(yǎng)條件相同), 在培養(yǎng)2 d后取出, 取下層液體, 在每個(gè)孔內(nèi)加入100 μl的甲醇溶液,并在零下20℃ 環(huán)境下固定20 min, 之后用PBS進(jìn)行清洗, 分三次共5 min完成；再次在小孔中加入Triton100溶液(濃度為0.1％, 劑量為100 μl), 在室溫下進(jìn)行透化, 時(shí)間為半小時(shí),之后用PBS進(jìn)行清洗, 方法同上；然后再加入BSA溶液(濃度為3％, 劑量為100 μl), 在室溫下進(jìn)行1 h的封存；最后將封存液丟棄, 在小孔內(nèi)加入相關(guān)試劑培養(yǎng), 并利用顯微鏡進(jìn)行拍照。第八步是對轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液進(jìn)行病毒滴度測試［2,3］。

2 結(jié)果

經(jīng)過試驗(yàn)后得出結(jié)果, 利用J6JFH1/△F轉(zhuǎn)染的病毒單邊反應(yīng)明顯減少, 對上清液毒滴度檢測明顯下降。同時(shí)F蛋白缺失型丙型肝炎病毒中翻譯毒蛋白的RNA含量也有所降低,病毒顆粒的產(chǎn)生顯著下降。但F蛋白缺失型丙型肝炎病毒的核心蛋白二級結(jié)構(gòu)基本沒有發(fā)生變化。

3 小結(jié)

經(jīng)過試驗(yàn)顯示, F蛋白對于病毒的復(fù)制性和感染性的影響力較低, 其本身對于丙型肝炎病毒的作用不大。同時(shí), 對F蛋白是否能夠行使C蛋白的功能也存在一定的異議, F蛋白對于宿主免疫系統(tǒng)的危害能力有待進(jìn)一步的研究。

［1］Boumlic A, Vassilaki N, Dalagiorgou G, et al. Internal translation initiation stimulates expression of the ARF/core+1 open reading frame of HCV genotype1b. Virus Res,2011,155(1):213-124.

［2］Yuksek K, Chen WL, Chien D, et al. Ubiquitin-independent degradation of hepatitis C virus F protein. J Virol,2009,83(2):612-613.

［3］王文博, 許剛, 王巖, 等. 丙型肝炎病毒F蛋白缺失對病毒復(fù)制及感染性的影響.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2012,39(2):142-143.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.05.198

2014-12-03］

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