吳曉康，馬超鋒，余鵬博，陳海龍，尹佳鋒，杜毛繩，武海濱，鄧慧玲

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710004；2.西安市疾病預(yù)防控制中心，陜西 西安 710054；3.陜西省疾病預(yù)防控制中心，陜西 西安 710054；4.西安市兒童醫(yī)院，陜西 西安 710003)

手足口病患兒腸道菌群結(jié)構(gòu)特征的分析

吳曉康1，馬超鋒2，余鵬博3，陳海龍2，尹佳鋒1，杜毛繩4，武海濱4，鄧慧玲4

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710004；2.西安市疾病預(yù)防控制中心，陜西 西安 710054；3.陜西省疾病預(yù)防控制中心，陜西 西安 710054；4.西安市兒童醫(yī)院，陜西 西安 710003)

目的 探索手足口病患兒腸道菌群結(jié)構(gòu)特征，了解腸道菌群與疾病的相關(guān)性。方法 收集手足口病住院患兒32例和健康兒童14例糞便樣本，提取腸道菌群總脫氧核糖核酸(DNA)，16SrDNA-V3區(qū)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)分子指紋圖譜和測(cè)序技術(shù)，分析手足口病患兒腸道菌群組成結(jié)構(gòu)、多樣性、相似性等生態(tài)學(xué)特征。結(jié)果 手足口病患兒與健康兒童相比，DGGE指紋圖譜的條帶數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)均顯著降低(t=3.92，P<0.05；t=3.24，P<0.05)，腸道菌群多樣性降低；比較兩組相似性系數(shù)和相似性系數(shù)累積曲線，手足口病患兒組內(nèi)相似性降低(Z=-9.12，P<0.05)，菌群結(jié)構(gòu)更趨不同；優(yōu)勢(shì)條帶切膠測(cè)序結(jié)果表明，手足口病患兒以厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)為主，腸道優(yōu)勢(shì)菌屬可能發(fā)生變化。結(jié)論 手足口病患兒腸道菌群結(jié)構(gòu)、組成發(fā)生變化，疾病的發(fā)生與腸道菌群具有一定的相關(guān)性。

手足口??；腸道菌群；變性梯度凝膠電泳；多樣性；相似性

手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)是一種由腸道病毒引起的傳染病，多發(fā)于兒童。近年來(lái)，此病容易集中流行，輕癥患兒經(jīng)治療后即可痊愈，而部分患兒出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致死亡，已經(jīng)成為威脅兒童身體健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。引起手足口病的病原主要為腸道病毒柯薩奇病毒A16型(Cox A16)和腸道病毒71型(EV71)[1]。

腸道菌群在機(jī)體代謝、免疫調(diào)節(jié)和屏障保護(hù)等起到重要作用。近來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變與多種疾病發(fā)生相關(guān)，如炎性腸病、肥胖、2型糖尿病、感染[2]等。有關(guān)手足口病與腸道菌群相關(guān)性的研究資料未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)分析感染EV71病毒所致手足口病患兒腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征和組成，試圖了解疾病情況下腸道菌群是否發(fā)生變化，為進(jìn)一步研究疾病發(fā)生與腸道菌群相關(guān)性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2013年在西安兒童醫(yī)院住院的手足口病患兒和社區(qū)幼兒園健康兒童糞便樣本，其中手足口病患兒32份，2～6歲，男20例，女12例；健康兒童14份，3～5歲，男8例，女7例。所有患兒經(jīng)西安市疾病預(yù)防控制中心病毒室病原核酸檢測(cè)均為EV71陽(yáng)性，同時(shí)均符合衛(wèi)生部公布的《手足口病診療指南(2010年版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，采樣程序符合醫(yī)院倫理學(xué)要求。選樣標(biāo)準(zhǔn)：①近1月內(nèi)未使用抗生素、益生菌或益生元等制品；②近1月內(nèi)無(wú)腹瀉、痢疾、結(jié)腸炎等腸道疾病。用一次性無(wú)菌便杯收集糞便標(biāo)本，密封后置冰盒中1h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室-80°C冰箱，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

本研究采用的儀器設(shè)備有：Dcode變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)、Gel DocTMXR凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)、2720型聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增儀(ABI/美國(guó))、GeneTools圖像分析軟件，NanoPhotometerTM(德國(guó)IMPLEN公司)，-80°C低溫冰箱(DW-40L262，三洋/日本)等。

1.2.2 主要試劑

本研究采用的主要試劑有：QIAamp Stool Mini Kit(Cat.no.51504，QIAGEN公司)、Taq酶，dNTP及緩沖液(Promega公司/美國(guó))，丙烯酰胺(Acr)，N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)(Promega公司)，過(guò)硫酸銨(天津市化學(xué)試劑三廠)，TEMED(sigma公司)，去離子甲酰胺，尿素(Amresco公司)，引物合成和產(chǎn)物測(cè)序(上海生工)。

1.3 方法

1.3.1 腸道菌群總脫氧核糖核酸提取

參照QIAamp DNA Stool Mini Kit提取糞便樣品中菌群總脫氧核糖核酸(DNA)的步驟。提取產(chǎn)物用微量核酸檢測(cè)儀NanoPhotometerTM測(cè)定DNA含量。

1.3.2 聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增

選擇細(xì)菌16SrRNA-V3區(qū)通用引物參照El-Sayed等[3-4]設(shè)計(jì)的引物V3-F：5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′，V3-R：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′，在正向引物5′端添加40bp的GC夾，有利于產(chǎn)物在變性梯度凝膠電泳(DGGE)中的分析。50μL PCR反應(yīng)體系包括：10×buffer 5μL，正向引物、反向引物(5μmol/L)各2μL，脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)(10mmol/L)1μL，氯化鎂(MgCl2)(2.5mmol/L)5μL，Taq DNA(5IU/μL)0.4μL，DNA模板4μL，水(H2O)30.6μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋翰捎媒德渚酆厦告湻磻?yīng)(touchdown PCR)方案程序[3-4]，即預(yù)變性95°C 5min，95°C變性1min，退火溫度初次設(shè)定為65°C 1min，延伸65°C 1min，最后退火溫度降到55°C，在此退火溫度再進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，72°C 7min，4°C保存。PCR產(chǎn)物用Nano Photometer TM檢測(cè)儀測(cè)定含量。

1.3.3 指紋圖譜分析

采用DCodeTM變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)物分析，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定16SrDNA-V3區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物最適變性梯度范圍(由上到下)為40%～75%，聚丙烯凝膠濃度為10%。取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混勻后加到上樣孔中，100V電壓電泳12h，溫度設(shè)置為60°C。電泳完畢后，將膠放入EB溶液(0.5g/mL)中染色20min，放置成像系統(tǒng)下觀察圖像并拍照保存。利用Quantity One軟件(Bio-Rad，USA)分析指紋圖譜中條帶數(shù)目、灰度值，分析手足口病患兒和健康兒童腸道菌群的多樣性、相似性等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 手足口病患兒組與健康兒童組腸道菌群多樣性分析

DGGE指紋圖譜上分離的條帶清晰可見(jiàn)，不同樣本的條帶呈現(xiàn)不同的數(shù)量、位置和亮度特征。所檢測(cè)的樣本中，條帶數(shù)范圍2～25條，其中3～9條帶較亮，圖譜可直觀清晰地反映腸道優(yōu)勢(shì)菌群，見(jiàn)圖1。多樣性分析，兩組樣本條帶數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)比較，手足口病患兒組低于健康兒童組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.92，P<0.05；t=3.24，P<0.05)。

2.2 手足口病患兒組與健康兒童組腸道菌群相似性分析

從圖1中可看到，兩組條帶位置分布呈現(xiàn)不同。采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)，計(jì)算出Dice相似性系數(shù)，健康兒童組內(nèi)個(gè)體之間相似性高于手足口病患兒組內(nèi)個(gè)體之間，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-9.12，P<0.05)，見(jiàn)表1，提示健康個(gè)體之間菌群組成更加相似，手足口病患兒之間菌群相對(duì)更趨于不同，菌群組成結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，所檢測(cè)樣本的聚類(lèi)分析見(jiàn)圖2。

注：C1～C14為健康兒童組，1～32為手足口病患兒組。

圖1 手足口病患兒組和健康兒童群腸道菌群DGGE圖

Fig.1 DGGE profile of gut microbiota in HFMD group and healthy group

注：橫坐標(biāo)為聚類(lèi)相似度，縱坐標(biāo)為樣本編號(hào)，C1～C14為健康兒童組，1～32為手足口病患兒組。

圖2 健康兒童與手足口病患兒DGGE指紋圖譜條帶聚類(lèi)分析

Fig. 2 Clustering analysis of DGGE band of gut microbiota in children with HFMD and healthy children

為了比較兩組內(nèi)個(gè)體之間菌群結(jié)構(gòu)的相似程度，計(jì)算并繪制了兩組內(nèi)個(gè)體之間的成對(duì)相似系數(shù)的累積分布曲線，見(jiàn)圖3，曲線反映的是相似性系數(shù)的分布特征，靠近Y軸的曲線表明有更多的相似性系數(shù)分布在低數(shù)值區(qū)，即更多的個(gè)體相互之間差異較大，腸道菌群結(jié)構(gòu)相似性較低。圖中曲線表明，小于0.5的Cs值在手足口病患兒組占到總Cs值個(gè)數(shù)的97%，而健康兒童只占到64%，這個(gè)結(jié)果表明手足口病患兒菌群結(jié)果趨于不同。

2.3 變性梯度凝膠電泳指紋圖譜優(yōu)勢(shì)條帶測(cè)序分析

選擇兩組DGGE圖譜上優(yōu)勢(shì)條帶切膠測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測(cè)序結(jié)果可以看到健康兒童組以擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)為主，而手足口病患兒組以厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)為主，見(jiàn)表2，表明兩組菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化。

圖3 兩組內(nèi)個(gè)體之間的成對(duì)相似系數(shù)的累積分布曲線

Fig.3 Accumulative distribution curves of dice similarity coefficient between two groups

表2 手足口病患兒組和健康兒童組DGGE條帶測(cè)序結(jié)果

Table 2 Sequences results of DGGE band in HFMD group and healthy group

注：從健康兒童組切膠14條，手足口病組切膠21條，*為手足口病組位置相同條帶的菌屬。

3 討論

手足口病是由腸道病毒引起的嬰幼兒常見(jiàn)傳染病。由于腸道病毒傳染性強(qiáng)、隱性感染比例大、傳播途徑復(fù)雜、傳播速度快，近年來(lái)本病容易出現(xiàn)暴發(fā)和短時(shí)間內(nèi)較大范圍流行。該病的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，有研究報(bào)道腸道病毒進(jìn)入消化道后在腸黏膜內(nèi)復(fù)制繁殖并持續(xù)釋放到血液，然后傳遍全身而發(fā)病，腸道黏膜是病毒入侵和增殖的主要場(chǎng)所[5-6]。人體腸道寄居著種類(lèi)繁多、數(shù)量巨大的細(xì)菌群落，它與宿主處于共生互利的狀態(tài)，對(duì)宿主發(fā)揮著重要的生理功能，正常的腸道菌群結(jié)構(gòu)可維持和增強(qiáng)腸道黏膜屏障功能，還能夠?qū)雇庠葱灾虏【亩ㄖ岛腿肭?，即腸道菌群的生物拮抗作用。

3.1 手足口病患兒腸道菌群多樣性特征分析

本研究則通過(guò)比較手足口病患兒與健康兒童腸道菌群結(jié)構(gòu)及組成差異，探討是否因?yàn)槟c道菌群結(jié)構(gòu)和組成的變化，導(dǎo)致腸道黏膜屏障功能的降低，而促進(jìn)疾病的發(fā)生。研究結(jié)果顯示手足口病患兒腸道菌群與健康兒童比較存在一定的差異。

從腸道菌群的多樣性上比較，患兒腸道菌群多樣性降低，分析其原因可能是病毒侵襲腸道黏膜，改變其腸道生態(tài)環(huán)境，造成菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，多樣性降低。尹斐弘和楊娟等[6-7]發(fā)現(xiàn)重癥手足口病患兒血漿內(nèi)毒素、二胺氧化酶和D-乳酸水平等指標(biāo)均高于正常兒童，認(rèn)為重癥手足口病存在黏膜屏障功能的損傷，同時(shí)腸道毒素等代謝產(chǎn)物入血造成內(nèi)毒素血癥。

3.2 手足口病患兒腸道菌群相似性特征分析

從兩組兒童腸道菌群的相似性分析上，通過(guò)組內(nèi)相似性的比較和相似性系數(shù)累積曲線可以看到，手足口病患兒組內(nèi)相似性降低，腸道菌群更趨于不同，即在腸道菌群多樣性降低的情況下，菌群的種類(lèi)也發(fā)生改變，此結(jié)果反映出患兒腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。Wang等[2]研究呼吸道流感病毒感染導(dǎo)致腸道炎癥發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制發(fā)現(xiàn)，在小鼠流感疾病發(fā)生過(guò)程中，腸道黏膜中有大量促炎癥的Th17細(xì)胞聚集，當(dāng)抑制Th17細(xì)胞來(lái)源的IL-17A的功能，可顯著減輕腸道炎癥損傷的程度；同時(shí)，小鼠腸道菌群的組成在流感疾病發(fā)生過(guò)程中也發(fā)生了改變，采用抗生素清除腸道細(xì)菌，能夠顯著地抑制Th17細(xì)胞的聚集并減輕腸道炎癥損傷，這表明腸道菌群的改變與Th17細(xì)胞的產(chǎn)生之間存在聯(lián)系。筆者認(rèn)為是否存在相類(lèi)似的機(jī)制，手足口病患兒感染腸道病毒EV71后，引起腸道菌群組成的改變，進(jìn)而引起腸道及全身性炎癥反應(yīng)，具有重要的研究?jī)r(jià)值。

3.3 手足口病患兒腸道優(yōu)勢(shì)菌屬分析

對(duì)指紋圖譜優(yōu)勢(shì)條帶切膠測(cè)序也發(fā)現(xiàn)手足口病患兒腸道優(yōu)勢(shì)菌屬組成發(fā)生變化。健康兒童以Bacteroidetes菌門(mén)Bacteroides屬為主要組成，而患兒以Firmicutes、Actino￣bacteria、Proteobacteria菌門(mén)為主要組成，兩組存在明顯不同。菌屬組成的不同對(duì)宿主腸道黏膜屏障功能起到不同的作用。黃永坤[5]研究表明，腸道菌群中的雙歧桿菌、乳酸桿菌等及代謝產(chǎn)物通過(guò)對(duì)腸上皮細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)而產(chǎn)生促進(jìn)增殖的作用，還可通過(guò)受體調(diào)節(jié)機(jī)制促進(jìn)腸道黏蛋白的分泌，阻止病原體與腸上皮細(xì)胞的結(jié)合，對(duì)維護(hù)黏液層屏障功能的穩(wěn)定有重要意義。

總之，腸道菌群和腸道黏膜屏障與疾病和健康有著密切的關(guān)系，通過(guò)全面深入的研究腸道菌群與手足口病的關(guān)系，將有利于進(jìn)一步探索手足口病的發(fā)病機(jī)制，為尋找手足口病治療新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

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[3]El-Sayed W S, Ibrahim R A. Diversity and phylogenetic analysis of endosymbiotic bacteria of the date palm root borer Oryctes agamemnon (Coleoptera: Scarabaeidae)[J].BMC Microbio-logy,2015,15:88.

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[專(zhuān)業(yè)責(zé)任編輯：程 茜]

Construction characteristics of gut microbiota in children with hand-foot-mouth disease

WU Xiao-kang1,MA Chao-feng2, YU Peng-bo3, CHEN Hai-long2,YIN Jia-feng1, DU Mao-sheng4, WU Hai-bin4, DENG Hui-ling4

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospitalofHealthScienceCenter,Xi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710004,China；2.CenterforDiseaseControlandPreventionofXi’an,ShaanxiXi’an710054,China；3.CenterforDiseaseControlandPreventionofShaanxi,ShaanxiXi’an710054,China；4.Xi’anChildren’sHospital,ShaanxiXi’an710003,China)

Objective To explore the characteristics of gut microbiota in children with hand-foot-mouth disease (HFMD) and investigate the correlation between gut microbiota and the disease. Methods Bacterial DNAs were extracted from the faecal samples of 32 patient children with HFMD and 14 healthy children, and PCR amplification was performed at 16SrDNA-V. Finger printing and sequencing of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) were used to analyze the composition, diversity and similarity of gut microbiota in patients with HFMD. Results Compared to healthy children, the number of DGGE bands and the Shannon-Wiener index of patients with HFMD were both significantly declined (tvalue was 3.92 and 3.24, respectively, bothP<0.05), and the diversity of gut microbiota decreased. Comparison of the similarity coefficient and the accumulative distribution curves of dice similarity coefficient of both groups indicated that the similarity in HFMD group was declining (Z=-9.12,P<0.05), and the construction of gut microbiota was different. The results of splitting predominant gel bands and sequencing also revealed that Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes were mainly represented in patients with HFMD, and that the dominant bacterial genera might change. Conclusion The composition and construction of gut microbiota in patients with HFMD have changed, which suggests that the occurrence of the disease has the correlation with gut microbiota.

hand-foot-mouth disease (HFMD); gut microbiota; denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE); diversity; similarity

2015-04-18

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目；陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展資助項(xiàng)目(2011K12-82)；西安市科學(xué)技術(shù)局醫(yī)療衛(wèi)生研究資助項(xiàng)目(SF1208)；國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)《病毒性傳染病病原譜流行規(guī)律及變異研究》資助項(xiàng)目(2013ZX10004202)

吳曉康(1977-)，男，助理研究員，博士，主要從事腸道菌群與疾病相關(guān)性研究。

鄧慧玲，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.04.002

R378；R725.1

A

1673-5293(2015)04-0660-03