益氣化瘀解毒法對慢性萎縮性胃炎伴異型增生大鼠APC、beta-catenin表達干預的實驗研究※

安 靜 楊晉翔 賀梅娟 彭繼升 魏 玥 賈雪晴

（1.北京中醫(yī)藥大學，100029 2.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院 3.中華中醫(yī)藥學會）

胃癌是一個逐步形成的過程，常由胃癌前病變（PLGC）進一步發(fā)展而來。胃癌前病變的早診斷和早干預可以阻斷其向胃癌的發(fā)展。PLGC分為腸上皮化生（IM）和異型增生（Dys）兩種，尤其是中重度異型增生。輕度Dys約15%～30%會進展為重度Dys和／或腺癌，而重度Dys的病人有60%～80%發(fā)展為胃癌。有效干預PLGC，阻斷其向胃癌的發(fā)展，對防治胃癌有積極意義。

中醫(yī)學將PLGC歸為“胃痞”，屬本虛標實之證。從微觀上辨識有“虛痞”“胃脘痛”“胃痞惡化”之實。以其辨證論治、個體化治療、多靶點干預、毒副作用小等為特點。中醫(yī)藥療法可多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點來干預阻斷逆轉PLGC，逐漸成為治療PLGC的重要手段。

實驗材料

1.實驗動物：無特定病原體（Specified Pathogen Free，SPF）Wistar實驗用雄性大鼠60只，4周齡，體重約100g。由京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物批號：SCXK（京）2012-0001。

2.實驗藥物：①消痞顆粒劑：為益氣化瘀解毒法方藥，由北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院藥劑科制成顆粒沖劑，12g／袋，每克沖劑含生藥9g。②維酶素片：為陽性對照組用藥，由河北環(huán)海藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號：20090506。③N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍［（N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG），又稱1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍］：由日本東京化成工業(yè)株式會社（Tokyo Chemical Industry Co.Ltd，TCI）生產(chǎn)，CAS登錄號：70-25-7，產(chǎn)品編號：M0527。

研究方法

1.模型的建立：參照相關文獻［1，2］采用以MNNG癌誘變劑灌胃為主多因素聯(lián)合建立慢性萎縮性胃炎伴異型增生大鼠模型。模型組大鼠自由飲用濃度為0.05%氨水溶液，氨水溶液每24h新鮮配制并更換1次，自由進食含0.03%鹽酸雷尼替丁清潔級大鼠飼料，予120μg／mL的MNNG溶液灌胃，每只5mL／kg·d。

2.隨機分組：SPF級雄性Wistar大鼠60只經(jīng)適應性飼養(yǎng)1周，根據(jù)體重因素按計算機生成隨機數(shù)字法隨機分為兩組?？瞻捉M10只，給以清潔級動物標準提供普通飼料喂養(yǎng)，持續(xù)至實驗結束。造模組50只，如上述造模方法和飼養(yǎng)條件進行干預，于實驗第20、24、26、28、30、32周分別隨機抽檢2只。第32周末造模成功，造模結束。

3.干預處理：第33周始將造模組剩余的33只大鼠考慮體重因素，按計算機生成分層，隨機分成三組，每組11只，以清潔級動物標準提供普通飼料和水飼養(yǎng)，自然恢復組予生理鹽水3mL／kg·d灌胃；維酶素組予維酶素懸濁液2mL／kg·d（即維酶素0.3g／kg）灌胃；消痞顆粒組予消痞顆粒懸濁液3mL／kg·d（含生藥9g／kg）灌胃。干預階段持續(xù)12周。所有實驗大鼠于第44周末處死。

4.標本處置：實驗第44周末，取材前各組大鼠禁食不禁水18h，使用1%戊巴比妥鈉按30mg／kg經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠后，迅速沿大彎側剪開，4%生理鹽水漂洗內(nèi)容物，再沿小彎側剪開，用濾紙吸干水分，切取病變胃黏膜組織，取胃竇組織10%甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色和免疫組化。

5.觀察指標及方法：（1）觀察大鼠胃黏膜組織病理組織學診斷及分級。病理分析標準采用2000年中華醫(yī)學會消化病學分會《全國慢性胃炎研討會共識意見》［3］和2006年中華醫(yī)學會消化病學分會全國第二屆慢性胃炎共識會議制定的《中國慢性胃炎共識意見》中的病理診斷標準［4］。（2）結果觀察和分析方法：使用圖像處理分析軟件Image-Pro Plus V 7.0（IPP 7.0）軟件觀察經(jīng)免疫組化染色后APC和beta-catenin蛋白的表達情況，在高倍鏡視野（×40）隨機選取5個視野攝像，并使用IPP7.0圖像分析軟件計算總面積內(nèi)的平均光密度值做半定量分析。

結果

1.大鼠病理變化情況：全部10例空白組均出現(xiàn)異型增生；自然恢復組大鼠胃黏膜持續(xù)萎縮，伴有IM及Dys，未見明顯組織修復現(xiàn)象，2例為輕度異型增生，2例為中度異型增生，3例為重度異型增生，僅1例未出現(xiàn)異型增生。維酶素組大鼠胃黏膜可見組織修復現(xiàn)象，2例為輕度異型增生，2例為中度異型增生，2例為重度異型增生，3例出現(xiàn)異型增生逆轉。消痞顆粒組大鼠胃黏膜可見明顯組織修復現(xiàn)象，2例為輕度異型增生，2例為中度異型增生，0例為重度異型增生，7例出現(xiàn)異型增生逆轉。消痞顆粒組大鼠的病理變化情況優(yōu)于自然恢復組（P＜0.05），維酶素組大鼠的病理變化情況與自然恢復組有差異（P＞0.05）。

2.各組大鼠APC和β-catenin蛋白表達情況：（1）各組大鼠APC蛋白表達：經(jīng)免疫組化圖像半定量分析得出，空白組有10例大鼠APC蛋白表達，自然恢復組有8例，維酶素組有9例，消痞顆粒組有11例。消痞顆粒組大鼠APC蛋白表達情況優(yōu)于維酶素組（P＜0.05）和自然恢復組（P＜0.01），但與空白組大鼠APC蛋白表達情況仍有差異（P＜0.01）。（2）各組大鼠betacatenin蛋白表達情況：經(jīng)免疫組化圖像半定量分析得出，空白組有10例大鼠beta-catenin蛋白表達，自然恢復組有8例，維酶素組有9例，消痞顆粒組有11例。經(jīng)統(tǒng)計分析比較，消痞顆粒組大鼠beta-catenin蛋白表達情況明顯優(yōu)于維酶素組（P＜0.01）和自然恢復組（P＜0.01），同時與空白組beta-catenin蛋白表達情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；維酶素組大鼠beta-catenin蛋白表達情況與自然恢復組比較，沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；自然恢復組大鼠beta-catenin蛋白表達情況與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（3）大鼠APC蛋白與beta-catenin蛋白表達關系：25例APC蛋白表達陽性的大鼠中有24例beta-catenin蛋白表達陽性，1例beta-catenin蛋白表達陰性；而13例APC蛋白表達陰性的大鼠中，有5例beta-catenin蛋白表達陽性，8例betacatenin蛋白表達陰性。經(jīng)兩變量相關分析檢驗，P＜0.01，可以認為大鼠APC蛋白與beta-catenin蛋白表達相關。

討論

PLGC的病機基礎為脾胃虛損，兼或氣陰兩虛。以益氣化瘀解毒法為組方的消痞顆粒通過益氣養(yǎng)陰消滯、活血化瘀、清熱解毒之法不僅改善臨床癥狀，而且消除異化之象，逆轉胃癌前病變。

Correa［5］根據(jù)病理組織學和流行病學研究將胃癌的發(fā)生發(fā)展描述為一個連續(xù)的組織病理學事件：正常胃黏膜→淺表性炎癥→萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型增生→胃癌。該模式已經(jīng)得到國內(nèi)外專家認可。胃癌前病變主要是指萎縮性胃炎伴不完全性腸化生和（或）中、重度異型增生［6］。近些年越來越多的臨床資料顯示腸上皮化生預測胃癌價值有限而更強調(diào)重視腸上皮化生范圍。因此，腸上皮化生分型的臨床意義和價值有限。

胃上皮異型增生與胃癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關。研究顯示，輕度異型增生的癌變率僅為2.27%，重度癌變率是25.00%，中度介于兩者之間［7］；輕度異型增生癌變的相對危險度為1.97［8］，中度和重度異型增生癌變的相對危險度分別高達正常人群的26倍和132倍［9］。目前西醫(yī)學對胃癌前病變的基礎研究取得了令人矚目的成果，但仍缺乏理想阻斷或逆轉這種病變的有效藥物和方法。中醫(yī)藥療法有其獨特優(yōu)勢，大量臨床治療及實驗研究表明，中醫(yī)藥療法［10～12］可使部分腸上皮化生和異型增生減輕或消失，對防治胃癌的發(fā)生和發(fā)展具有十分重要的意義。

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，經(jīng)過多階段、多途徑協(xié)同作用逐步發(fā)展形成。本研究探討益氣化瘀解毒法對胃癌前病的較好療效是通過作用于多基因、多途徑實現(xiàn)的，其對Wnt傳導通路成分APC、beta-catenin表達的調(diào)節(jié)是其可能作用機制之一，從而達到防治胃癌的發(fā)生和發(fā)展的作用。

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