李春榮 孟鐵宏 王 恒

黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校公共課教學(xué)部化學(xué)教研室，貴州 都勻 558000

苗藥烏糾不同提取部位的止血活性研究

李春榮 孟鐵宏 王 恒

黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校公共課教學(xué)部化學(xué)教研室，貴州 都勻 558000

目的：探討烏糾的止血活性部位，為其止血活性成分的篩選提供線索和依據(jù)。方法：用60%乙醇對(duì)烏糾原藥材活性成分進(jìn)行提取，回收乙醇，然后依次用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯對(duì)醇浸膏進(jìn)行萃取，分別制得相應(yīng)的部分和水部分。然后通過測(cè)定小鼠凝血時(shí)間、出血時(shí)間和血小板計(jì)數(shù) （PLC）等方法考察其活各部分的止血效果。結(jié)果：石油醚部分、正丁醇部分、乙酸乙酯部分和水部分均有止血作用，烏糾中石油醚提取物的止血效果最佳。

烏糾；出血；活性部位

苗藥烏糾系鐵角蕨科鐵角蕨屬植物變異鐵角蕨（Asplenium varians Wall.ex Hook.et Grev.）的全草，又名九倒生、鐵郎雞、地柏枝，主要分布于云南、貴州、四川至山西等地，是貴州苗族居住地區(qū)傳統(tǒng)的民間藥物，其性涼，味微苦，具有活血消腫、止血生肌的作用［1］。目前，鐵角蕨屬植物的化學(xué)成分和藥理研究已有相關(guān)報(bào)道［2］，但關(guān)于苗藥烏糾化學(xué)成分及止血活性部位的研究還未見報(bào)道。本文在對(duì)烏糾進(jìn)行分段提取的基礎(chǔ)上，考察烏糾的石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物對(duì)小鼠止血活性的實(shí)驗(yàn)，為進(jìn)一步研究其止血活性成分及止血機(jī)制提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 藥材 烏糾：產(chǎn)地貴州黔南、黔東南苗族地區(qū)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定為鐵角蕨科鐵角蕨屬植物變異鐵角蕨（Asplenium varians Wall.ex Hook.etGrev.）的全草；云南白藥（瓶裝）（批號(hào)：ZL13022，云南白藥集團(tuán)股份有限公司）。

1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠，清潔級(jí)，體重（20±2）g，雌雄各半，由貴陽醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（黔）2002－0001。

1.3 試劑 石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇均為分析純。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 供試液的制備 取干燥烏糾，粉碎，過20目篩，稱取1000g，于10L圓底燒瓶，用60%乙醇，80℃下回流提取2.5h，抽濾，平行提取3次，合并抽濾液，濾液經(jīng)減壓回收乙醇，至無醇味，得到烏糾粗提取物。然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收有機(jī)溶劑，真空干燥 （60℃），制成干浸膏［3］，分別得到石油醚提取物部位、正丁醇提取物部位、乙酸乙酯提取物部位和水提取物部位浸膏，并稱定各提取物，臨用前，用0.1%－CMC配成適宜濃度的溶液。

1.4.2 出血時(shí)間（BT）的測(cè)定（斷尾法） 取小鼠60只，隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組、云南白藥組 （即陽性對(duì)照組，0.5g／kg）和石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組及水提物組4個(gè)給藥組 （提取物），試驗(yàn)小鼠每個(gè)給藥組10只，雌雄各半。稱取一定量的提取物用0.1%－CMC配成3g／kg藥劑，分別灌胃給藥1次／d，連續(xù)7d。末次給藥后30min，小鼠夾固定，將小鼠尾尖0.5cm處橫向切斷，當(dāng)血液自動(dòng)流出時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔30s用濾紙吸去血滴1次，到血液不再流出為止 （濾紙吸時(shí)無血）［4－5］，以人工創(chuàng)面形成到出血停止所用時(shí)間作為出血時(shí)間。

1.4.3 凝血時(shí)間（CT）測(cè)定 取小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為6組，分組給藥均與1.4.2方法相同，末次給藥后30min，用眼科彎鑷迅速摘去一側(cè)眼球即有血液流出，用棉球擦去第一滴血，再于載玻片兩端各滴1滴血，血滴直徑約為5mm，立即記時(shí)，每隔30s用清潔大頭針自血滴邊緣向里輕輕挑動(dòng)1次，并觀察有無血絲挑起。從采血開始至挑起血絲止所需時(shí)間即為凝血時(shí)間。

1.4.4 小鼠血小板計(jì)數(shù)（PLC） 取小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為6組，分組給藥均與1.4.2方法相同，末次給藥后30min，用毛細(xì)取血管在小鼠眼內(nèi)眥球采血10μL用血小板稀釋液稀釋100倍，普通光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)（PLC）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)以表示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙樣本t檢驗(yàn)和方差分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)小鼠出血（BT）時(shí)間的影響 與空白生理鹽水組比較，烏糾的石油醚提取部位、乙酸乙酯提取部位、水提取部位和云南白藥組均能顯著縮短小鼠出血時(shí)間，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中水提取部位的效果最佳，出血時(shí)間為（93.75±37.39）S。具體見表1。

2.2 對(duì)小鼠凝血時(shí)間（CT）的影響 和空白生理鹽水組對(duì)比，石油醚提取部位、正丁醇提取能明顯縮短小鼠凝血時(shí)間，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而乙酸乙酯提取物部分對(duì)小鼠凝血時(shí)間效果不明顯。小鼠凝血時(shí)間見表2。

2.3 對(duì)小鼠血小板計(jì)數(shù)（PLC）的影響 由表3可見，與空白生理鹽水組比較，烏糾的石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物均能顯著加快血小板的凝聚作用，其促凝作用最大的為乙酸乙酯部位，其中水提取物部分的效果最佳。

3 討論

小鼠斷尾出血時(shí)間和玻片凝血時(shí)間由于方法直觀，操作簡(jiǎn)便，廣泛用于止血中藥活性的篩選。出血時(shí)間是指皮膚受特殊刺破后出血并自動(dòng)停止所需的時(shí)間，常用于評(píng)價(jià)皮膚毛細(xì)管的止血能力，也是觀察受試藥物對(duì)凝血機(jī)制有無影響的第一步［8］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，烏糾提取物的石油醚部位、乙酸乙酯部位和水提取部位均能顯著縮短小鼠出血時(shí)間；凝血時(shí)間是指血液離開機(jī)體后到完全凝固所需要的時(shí)間，它的長(zhǎng)短反映血液中參與凝血的各種凝血因子的含量以及它們的功能，其中血小板的數(shù)量和功能以及毛細(xì)血管功能是決定性因素，在凝血時(shí)間的實(shí)驗(yàn)中，只有乙酸乙酯部位對(duì)小鼠凝血效果不明顯，石油醚、正丁醇和水提取物均對(duì)小鼠凝血效果明顯，且能有效降低小鼠的血小板數(shù)量。石油醚部位的出血時(shí)間、凝血時(shí)間與云南白藥的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)接近，說明烏糾提取物中石油醚部位的止血效果最好，其凝血活性成分、凝血機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

根據(jù)出血時(shí)間 （BT）和凝血時(shí)間 （CT）實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏糾的石油醚部位和水提取部位具有良好的止血和凝血活性，證明了苗藥烏糾是一味止血良藥，也為進(jìn)一步探究苗藥烏糾的止血活性成分分析及止血機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

［1］王玲，何兆榮.藥用蕨類植物化學(xué)成分研究進(jìn)展 ［J］.中國(guó)野生植物資源，2006，3（10）：25－26.

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Study on different extracts form m iao medicine Asplenium varians W all.ex Hook.et Grev.on hemostasis activity

LIChun-rong*MENG Tie-hong WANG Heng
Chemistry teaching-research section of basic department，Qiannan Medical College for Nationalities，Duyun，558000，Gui zhou，China

Objective To determine the active position of Asplenium varians Wall.ex Hook.etGrev.and offer references to the selection of its active composition.M ethods The crud Asplenium varians Wall.ex Hook.et Grev.was extracted by 60%ethanol solution，then the petroleum ether extract，ethyl acetate extract，n-butanol extract and water extractwere extracted from ethanol extraction by petroleum ether，ethyl acetate and n-butanol，the active position was determined bymeasuring the time ofmice blood coagulation，hemorrhage and thrombocytometry.Results Petroleum ether extract，ethyl acetate extract，n-butanol extractand water extractallhave the hemostasis effect.Conclusion The best hemostasis effect from petroleum ether in Asplenium varians Wall.ex Hook.et Grev.

Asplenium varians Wall.ex Hook.et Grev；hemorrhage；active part

R29

A

1007－8517（2015）11－0001－02

2015.04.06）

貴州省廳校科技聯(lián)合基金（Gzwkj2012－2－018）；黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基金（QNYZ201319）。

李春榮（1983－），漢族，講師，碩士，主要從事：天然藥物化學(xué)、分析化學(xué)教學(xué)研究。E－mail：lichunrong68＠163.com