反相液相色譜法對飼料中添加金霉素的檢測分析

高慶田

(遼寧省丹東市獸藥飼料監(jiān)察所,遼寧省丹東 118002)

反相液相色譜法對飼料中添加金霉素的檢測分析

高慶田

(遼寧省丹東市獸藥飼料監(jiān)察所,遼寧省丹東 118002)

金霉素是四環(huán)素族中抗菌能力最強(qiáng)的廣譜抗生素，作為抗生素優(yōu)點(diǎn)很多，但長期使用甚至濫用的弊端也越來越嚴(yán)重。為摸清本地生產(chǎn)、經(jīng)營環(huán)節(jié)飼料中實(shí)際添加金霉素的狀況，我所采用反相液相色譜法分4次跟蹤監(jiān)測2013、2014年本地區(qū)豬飼料34批次、雞飼料47批次共計(jì)81批次樣品，從檢測結(jié)果分析目前飼料中添加金霉素實(shí)際情況。

反相液相色譜法 金霉素 檢測 分析

1 材料

1.1 藥品和試劑

所用試劑，除特別注明外均為分析純。水為蒸餾水，色譜用水為超純水。氫氧化鈉，乙二酸溶液（0.01mol/L），鹽酸溶液（4mol/L），乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），提取液（丙酮+4mol/L鹽酸溶液+水=13+1+6），金霉素對照品，中國藥品生物制品檢定所（批號30489-200202，純度94.5%）。

1.2 儀器和設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（湘儀TGL-18G-C），雷磁PH計(jì)，恒溫振蕩器（YH-4），0.45um微孔濾膜，waters色譜柱，分析天平（島津AUB120D），2695型高效液相色譜儀（配有2998二極管矩陣檢測器，美國waters公司）。

1.3 樣品

分別于2013年上、下半年、2014年上、下半年在4個(gè)縣區(qū)生產(chǎn)環(huán)節(jié)、經(jīng)營環(huán)節(jié)抽取豬配合、濃縮飼料34批次，雞配合、濃縮飼料47批次。

2 流動(dòng)相和標(biāo)準(zhǔn)品制備

2.1 流動(dòng)相

乙二酸溶液（0.01mol/L）+乙腈（色譜純）+甲醇（色譜純）=10+3+2

2.2 金霉素標(biāo)準(zhǔn)液

使用感量0.00001g的電子天平準(zhǔn)確稱取金霉素標(biāo)準(zhǔn)品0.01323g，置于50ml容量瓶中，用提取液溶解并定容至刻度，制成濃度為250mg/L金霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，貯于4-6℃，有效期1周。用移液器準(zhǔn)確移取4ml金霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10ml容量瓶中，用提取液稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為100mg/L金霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3 樣品制備

3.1 樣品粉碎

將采集的樣品300g左右，用四分法縮至100g左右，粉碎通過0.45mm孔徑篩，充分混勻，備用。

3.2 樣品提取

使用感量0.1g分析天平秤取已粉碎試樣1g，置于具塞錐形瓶中，加入100ml提取液，手搖2min，再用4mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至1.0～1.2，記錄鹽酸用量，作為稀釋倍數(shù)，蓋緊塞子，置恒溫振蕩器（110r/min）振蕩30min。將離心后的上層液體倒入100ml離心管，3000r/min離心15min，用5ml一次性注射器取上層離心液，用0.45um濾膜過濾，濾液上機(jī)。

3.3 色譜條件

以乙二酸溶液（0.01mol/L）+乙腈（色譜純）+甲醇（色譜純）（10+3+2）為流動(dòng)相，流動(dòng)相流速1.0ml/min，色譜柱C18：柱長150mm、內(nèi)徑4.6mm、粒度5um，柱溫室溫（25℃），檢測器為紫外檢測器，檢測波長375nm，進(jìn)樣量10ul。

4 結(jié)果分析

4.1 專屬性考察

金霉素出峰保留時(shí)間在4.595min；空白添加金霉素出峰保留時(shí)間在4.596min；空白溶液在4.012min以后無檢出峰。標(biāo)準(zhǔn)品金霉素吸收峰與雜質(zhì)峰分離度大于1.5，符合要求。

4.2 回收率

81批次供試品分4次上機(jī)檢測，每次上機(jī)附加1批次空白樣品和1批次空白添加，空白添加量均為100mg/kg，加標(biāo)回收率分別為85.2%、86.7%、84.9%、85.1%。

4.3 結(jié)果的計(jì)算

用計(jì)算公式X=C×P1×n×V／P／m／V計(jì)算金霉素含量（g/ L）。式中：X-試樣中所含金霉素的質(zhì)量（mg/kg）；P1-樣品峰面積；n-樣品稀釋倍數(shù)（100+1.3.2消耗鹽酸體積）；V-進(jìn)樣體積ul；p-標(biāo)準(zhǔn)品峰面積；m-樣品稱樣量g；

4.4 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

共檢測81批次樣品，其中80批次合格，1批次超標(biāo)，合格率98.8%。

5 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)是按照GB/T19684-2005標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行操作，最低檢出濃度為4mg/kg。按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)際操作，標(biāo)準(zhǔn)品出峰保留時(shí)間在4.595min，標(biāo)準(zhǔn)品峰型完整，分離完全，無分叉拖尾現(xiàn)象，標(biāo)準(zhǔn)品金霉素吸收峰與雜質(zhì)峰分離度大于1.5，方法回收率在85%-87%之間，說明此標(biāo)準(zhǔn)適合配合飼料、濃縮飼料中金霉素檢測。但經(jīng)過幾次檢測，發(fā)現(xiàn)GB/T19684-2005標(biāo)準(zhǔn)有三處錯(cuò)誤，一是金霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液配置完成后，其濃度標(biāo)準(zhǔn)上寫的是250g/L，實(shí)際應(yīng)該為250mg/L；二是金霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液不應(yīng)該用超純水稀釋至刻度并定容，應(yīng)該用提取液稀釋至刻度并定容；三是金霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液定容后，其濃度標(biāo)準(zhǔn)上寫的是100g/L，實(shí)際應(yīng)該為100mg/L。

6 討論

本次抽檢共檢測81批次樣品，僅1批次超標(biāo)，合格率98.8%，高的合格率并不代表飼料質(zhì)量絕對安全。對檢測結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在被檢的34批次豬飼料和47批次雞飼料中，金霉素檢出情況分別為9批次和4批次，檢出率為26.5%和8.5%。如此高的檢出率說明豬、雞飼養(yǎng)環(huán)節(jié)添加使用金霉素非常普遍。從這一檢測結(jié)果同時(shí)折射出，我國飼料行業(yè)抗生素使用頻次非常高，甚至可以說達(dá)到濫用的程度。希望決策部門在藥物添加劑批準(zhǔn)時(shí)應(yīng)該更加謹(jǐn)慎，對飼料企業(yè)的審查應(yīng)該更加嚴(yán)格；飼料企業(yè)取得藥物添加劑批準(zhǔn)文號后應(yīng)該增強(qiáng)社會(huì)責(zé)任意識，加強(qiáng)自律，嚴(yán)格按實(shí)際要求生產(chǎn)，盡可能地不添加抗生素；監(jiān)管部門應(yīng)該加大監(jiān)管力度，嚴(yán)厲打擊違法添加事件，防止抗生素濫用。