康桂英

(內(nèi)蒙古民族大學動物科學技術(shù)學院,內(nèi)蒙古通遼 028000)

口蹄疫診斷技術(shù)的研究進展

康桂英

(內(nèi)蒙古民族大學動物科學技術(shù)學院,內(nèi)蒙古通遼 028000)

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失，被世界衛(wèi)生組織列為A類傳染病。由于該病傳播迅速、難以防治，所以，準確而快速的診斷技術(shù)成為防治該病的必要措施。目前，口蹄疫的檢測技術(shù)主要有病毒培養(yǎng)與鑒定、血清學檢測技術(shù)和分子生物學技術(shù)等。

1 病毒培養(yǎng)與鑒定

首先，從患病家畜無菌采集病料，做病原體的分離培養(yǎng)與鑒定。將提取物在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，然后，根據(jù)培養(yǎng)物的特性做出診斷。到目前為止，從病料中分離提取病原體是檢測口蹄疫最可靠的方法。

1.1 細胞培養(yǎng)

口蹄疫病毒的分離培養(yǎng)最初采用單層初代豬腎細胞，隨著培養(yǎng)系統(tǒng)的完善和細胞培養(yǎng)技術(shù)的創(chuàng)新，發(fā)現(xiàn)了許多新的培養(yǎng)口蹄疫病毒的細胞，常見的有初代小牛甲狀腺細胞、小牛腎細胞、乳倉鼠細胞等。楊永欽等用BHK-21細胞來傳代培養(yǎng)兔毒O型兩個毒株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)少量毒株在116代后可觀察到點狀細胞脫落、隨著傳代次數(shù)增加細胞病變嚴重。在對于AsiaⅠ兔化毒在BHK-21細胞傳代培養(yǎng)在22代時就出現(xiàn)細胞脫落。王光祥等用仔豬心肌原代細胞對口蹄疫病毒進行培養(yǎng)，然后再用ELISA檢測方法對所培養(yǎng)的病毒進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)前后病毒完全一樣。

1.2 動物接種

目前，用于口蹄疫病毒鑒定的動物有：乳鼠、豚鼠、倉鼠、乳兔、雞胚，以乳鼠、豚鼠最常用。從病料中將病原體分離提取后，接種于2～7日齡乳小鼠，在24h左右觀察小鼠變化，結(jié)果小鼠行動不便，四肢僵直，呼吸急促，最終導致小鼠死亡。豚鼠也經(jīng)常作為口蹄疫實驗感染的實驗動物，將口蹄疫病毒于豚鼠腿部的皮膚或在頸部皮內(nèi)接種，第二日在接種部位可見到水泡，隨后水泡慢慢消失，沒有發(fā)現(xiàn)糜爛面，但是在口腔中發(fā)現(xiàn)水泡。

2 血清學診斷

2.1 凝集抑制試驗

有些病毒具有凝集某種動物紅細胞的能力，稱為病毒的血凝，利用這種特性設(shè)計的試驗稱血球凝集試驗，通過血凝與血凝抑制試驗，可用已知血清來鑒定未知病毒，也可用已知病毒來檢查被檢血清中的抗體滴度。

2.1.1 正向間接血凝試驗

該方法是指用滅活的口蹄疫病毒致敏綿羊紅細胞，然后用其檢測血清中抗體。曹旭[4]在內(nèi)蒙古地區(qū)提取分離出牛O型口蹄病毒，并且制備成高免血清，并采用綿羊紅細胞制成正向間接血凝液。利用制備的正向間接血凝液對內(nèi)蒙古地區(qū)牛口蹄疫免疫血清進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法能高效、快速檢測免疫血清抗體。趙明娟等[5]用正向間接血凝方法與液相阻斷ELISA方法對O型口蹄疫抗體合格率檢測進行對比試驗，發(fā)現(xiàn)正向間接血凝方法比液相阻斷ELISA方法使用設(shè)備少，操作簡單，價廉。

2.1.2 反向間接血凝試驗

該方法是用針對口蹄疫病毒的特異性抗體致敏紅細胞，然后用其檢測樣品中的口蹄疫病毒。李世軍將口蹄疫病毒在BHK-21細胞分離培養(yǎng)后，并用豬O型口蹄疫病毒IgG抗體進行熒光標記，最后采用反向間接血凝試驗成功檢測出病毒所在位置。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA作為一種新的診斷方法在近些年來得到飛速發(fā)展，經(jīng)過許多研究者多年的努力，現(xiàn)已形成液相阻斷ELISA、固相競爭ELISA以及間接夾心ELISA等多種ELISA診斷方法。

2.2.1 液相阻斷ELISA

Hamblin等用液相ELISA方法與VNT對口蹄疫抗體檢測比較試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于病毒在液相狀態(tài)下其抗原處于自然狀態(tài)可以和血清更好的反應。所以，不用特定培養(yǎng)分離病毒比VNT更加安全、快捷，使得對于口蹄疫的診斷環(huán)境要求更加簡便。在2005年，馬軍武等首次用液相阻斷ELISA檢測AsiaⅠ型口蹄疫。液相阻斷ELISA可以快捷、準確、靈敏的檢測出血清中抗體含量。該方法在臨床實踐中的應用將ELISA推上了一個新階段。

2.2.2 固相競爭ELISA

固相競爭ELISA方法檢測口蹄疫血清中抗體與液相阻斷ELISA相比較其敏感性相似。2008 年林密[9]等建立了O型口蹄疫病毒固相競爭ELISA 抗體檢測方法，并用該方法對92份非口蹄疫區(qū)無免疫牛血清進行檢測，發(fā)現(xiàn)血清抗體效價均低于1.32。由此，確立了判斷O型口蹄疫血清抗體效價的標準值是大于或等于1.32。在與液相阻斷ELISA相比較試驗，得出固相競爭ELIA特異性要比液相阻斷ELISA特異性高10.8%。

3 分子生物學診斷技術(shù)

該方法是指在特定的條件下，以被檢病料中少量的病原遺傳物質(zhì)為模版，在體外迅速擴增該遺傳物質(zhì)的過程。該方法具有靈敏度高、省時、操作簡便等特點，所以該方法被廣泛用于口蹄疫的診斷。在1999年，我國科學家吳時友等[10]用PCR反應擴增110bp寡聚核酸片段，并由光敏生物素標記和TdT催化進行的3＇末端標記而成的寡聚核苷酸探針，在經(jīng)過NC膜上斑點雜交試驗可以檢測出患病死亡動物體內(nèi)的口蹄疫病毒。在1996年，朱彩珠[11]等用BHK-21細胞培養(yǎng)口蹄疫病毒、乳鼠傳代口蹄疫病毒、豬水泡皮和牛舌皮等作為病毒材料，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RTPCR）技術(shù)快速、簡捷的檢測出牛O-P液中的口蹄疫病毒，在與常規(guī)的檢測技術(shù)相比較試驗中，RT-PCR比常規(guī)檢測技術(shù)靈敏度提高了12倍左右。到2005年，包慧芳等[12]在口蹄疫病毒3D基因區(qū)設(shè)計一組特異的引物和探針并對其進行熒光標記實時定量RTPCR，可以快速檢測口蹄疫病毒，且可對病毒進行定量檢測，具有高度的特異性和實時性。這種定時定量的方法進一步完善和推動了PCR技術(shù)在FMDV檢測中的應用。

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康桂英（1976-），女，內(nèi)蒙古涼城人，碩士，主要從事寄生蟲及寄生蟲病的研究。

項目來源：內(nèi)蒙古民族大學科學研究基金資助項目（項目編號：NMD1215）