徐云明 趙 勇 徐孝宙 仲思遠(yuǎn) 陳志強(qiáng)

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇句容 212400)

雞大腸桿菌病及禽霍亂混合感染的診斷

徐云明 趙 勇 徐孝宙 仲思遠(yuǎn) 陳志強(qiáng)

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇句容 212400)

傳統(tǒng)獸醫(yī)在臨床診斷家禽傳染性疾病時(shí)僅僅依靠臨床綜合診斷，但目前臨床上家禽可能不感染某一種傳染病，而是多種傳染病混合感染。本文應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法與臨床診斷方法配合，診斷了禽大腸桿菌病與禽霍亂混合感染病例，并應(yīng)用藥敏試驗(yàn)進(jìn)行藥物篩選和治療。

PCR 配合 診斷

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一種很普及的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于臨床診斷和分子生物學(xué)研究。PCR是由DNA聚合酶在體外擴(kuò)增特定的核酸（NA）序列。PCR技術(shù)的飛躍發(fā)生在1983年，當(dāng)Kary Mullis推廣使用了伴隨溫度循環(huán)的熱穩(wěn)定聚合酶[1-3]。PCR的普遍應(yīng)用在于其能把數(shù)量很少的靶核酸序列，擴(kuò)增成大量的PCR產(chǎn)物，然后通過下游方法檢測，例如通過瓊脂糖凝膠電泳觀察核酸（NA）產(chǎn)物。這是由于核酸（NA）序列的指數(shù)擴(kuò)增，使得起始模板擴(kuò)增產(chǎn)生數(shù)百萬的拷貝。

1 發(fā)病情況

2015年6月，江蘇省某農(nóng)場在水庫下游棚養(yǎng)10 000只雞，180日齡公雞、母雞各5 000只，在大棚兩邊有兩條死水溝，雨天上游水庫的水會(huì)進(jìn)入到水溝內(nèi)。養(yǎng)殖人員每天會(huì)定時(shí)喂水，但自動(dòng)喂水器內(nèi)無水的情況下，不會(huì)補(bǔ)水，由于雞是散養(yǎng)，可以采食到水溝內(nèi)的污水。養(yǎng)殖人員發(fā)現(xiàn)每天有十幾到幾十只雞發(fā)生死亡，體重均在1.25kg以上，雨天后死亡數(shù)量有所增加。根據(jù)臨診綜合診斷，初步診斷結(jié)果是大腸桿菌病與巴氏桿菌病混合感染，為確診，做了實(shí)驗(yàn)室檢查。

2 材料與方法

2.1 試劑與儀器

2.1.1 儀器

超凈工作臺（AIRTECH BCM-1300），eppendorf移液器，PCR反應(yīng)儀器，瓊脂糖電泳儀器，瓊脂糖電泳電源，Bio-RAD核酸凝膠成像系統(tǒng)。

2.1.2 試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、PCR反應(yīng)液，50X核酸電泳緩沖液、瓊脂糖電泳粉，核酸染料，藥敏片，DNA markerⅢ。

2.2 引物設(shè)計(jì)

引物選用文獻(xiàn)中大腸桿菌和多殺性巴氏桿菌的序列[4，5]，通過基因比對和NCBI庫內(nèi)的Blastn進(jìn)行特異性比對，比對結(jié)果顯示兩對引物特異性良好，予以采用。引物由上海生工合成（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷方法

3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)鑒定

（1）無菌采取3只病死雞病理變化最嚴(yán)重肝臟和脾臟，應(yīng)用無菌的剪刀及鑷子剪開，在無菌瓊脂培養(yǎng)基上氈板培養(yǎng)，37℃ 培養(yǎng)12～16h。

（2）對氈板培養(yǎng)出的細(xì)菌，選擇外觀差異較大的菌落進(jìn)行一一營養(yǎng)瓊脂平板劃線培養(yǎng)，37℃ 培養(yǎng)12～16h。

（3）對劃線培養(yǎng)出的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并鏡檢觀察。

3.2 PCR方法診斷

（1）應(yīng)用選取大腸桿菌與多殺性巴氏桿菌兩套引物，分別對劃線培養(yǎng)的瓊脂平板上形態(tài)存在明顯差異的菌落進(jìn)行PCR診斷，共挑取18個(gè)菌落（形態(tài)差異各9個(gè)菌落）。PCR反應(yīng)體系為50 μl，反應(yīng)體系內(nèi)各組分如下：Reaction buffer（2X）（含DNA聚合酶）12.5μl，引物（10 uM）各0.1μl，最后應(yīng)用雙蒸餾無菌水補(bǔ)至50μl。PCR反應(yīng)條件：①95℃ 5min，②95℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 45s、35次循環(huán)，③72℃ 5min。

（2）PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)，觀察結(jié)果。

4 實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果

4.1 病原菌培養(yǎng)結(jié)果

從原始病料進(jìn)行氈片培養(yǎng)結(jié)果來觀察，包括主要兩類病原菌，一類是營養(yǎng)情況較好的菌苔形態(tài)，還有一類是菌落存在。經(jīng)過劃線分離培養(yǎng)鑒定的菌落外觀觀察僅存在兩類不同形態(tài)的菌落。一類外觀邊緣整齊，圓潤隆起，半透明，灰白色；另一類菌落菌落邊緣不整齊（粗糙），生長狀況較前者稍差。分析前者是大腸桿菌，后者為需要營養(yǎng)條件較高的多殺性巴氏桿菌。

對菌落邊緣整齊，圓潤隆起的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察結(jié)果是革蘭氏染色為陰性無芽孢的直桿菌，大多數(shù)菌株以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，菌體兩端偶有略深染。對邊緣不整齊的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察結(jié)果是革蘭氏陰性短桿狀或球狀，多單個(gè)存在。

4.2 PCR方法

（1）禽霍亂檢查結(jié)果

應(yīng)用多殺性巴氏桿菌引物對分離培養(yǎng)得到的菌落進(jìn)行檢測，如圖1所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4、5、6、10、11、12、17、18菌落檢測結(jié)果，陽性結(jié)果在200-500bp之間，靠近500bp，這與文獻(xiàn)[4]所說的457bp相符合，證明檢測出的病原是多殺性巴氏桿菌。

圖1 禽霍亂PCR檢測結(jié)果(bp)

(2)大腸桿菌檢查結(jié)果

應(yīng)用大腸桿菌引物對分離培養(yǎng)得到的菌落進(jìn)行檢測,如圖2所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,11、13、14、16、18陽性結(jié)果,條帶大小在500與800bp之間,靠近500bp'與文獻(xiàn)［5］所說的622 bp相符,證明是大腸桿菌感染。

圖2 禽大腸桿菌病PCR檢測結(jié)果（bp）

實(shí)驗(yàn)室綜合診斷結(jié)果是兩種病原微生物，分別是大腸桿菌和多殺性巴氏桿菌。臨床綜合診斷結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果相結(jié)合，判定為雞大腸桿菌病與禽霍亂混合感染。

5 治療方法

5.1 藥敏實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

（1）選取諾氟沙星（編號1）、氧氟沙星（編號2）、多粘菌素B（編號3）、復(fù)方新諾明（編號4）、克林霉素（編號5）、卡那霉素（編號6）、多西環(huán)素（編號7）、新霉素（編號8）、氯霉素（編號9）、慶大霉素（編號10）、青霉素（編號11）、氨芐西林（編號12）、頭孢曲松（編號13）、共13種藥物。

（2）應(yīng)用上述13種藥物對器官氈片的平板進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，37℃，培養(yǎng)12-16小時(shí)。

（3）如表1、圖3所示，病理器官（肝、脾）氈片培養(yǎng)板上，13號藥物的抑菌環(huán)最大，最大達(dá)到33.10 mm，并且可以抑制平板上的所有細(xì)菌，因此選取13號藥物頭孢曲松進(jìn)行治療。

表1 藥敏實(shí)驗(yàn)抑菌環(huán)結(jié)果（mm）

5.2 治療措施

（1）根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用5%濃度的頭孢曲松可溶性粉供雞只自由采食，治療時(shí)間維持5～7d。

（2）叮囑養(yǎng)殖人員及時(shí)補(bǔ)充自動(dòng)采水器中的水。

（3）對棚舍兩邊的死水溝進(jìn)行消毒，應(yīng)用5%聚維酮碘，1：1500進(jìn)行消毒，7d/次。

5.3 治療結(jié)果

五天后電話回訪，病情得到控制，雞群沒有再出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

6 討論

從結(jié)果看出，其中1、2、3、7、8、9、15菌落未檢測出大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌陽性結(jié)果。證明病死雞中應(yīng)該還混有其他細(xì)菌，說明本次病死雞的發(fā)病可能還存在其他細(xì)菌的混合感染。

目前，臨床上常見的禽類的傳染性疾病不再是某種傳染病的單一感染，更多見的是兩種甚至兩種以上傳染病的混合或相互繼發(fā)感染，給獸醫(yī)從業(yè)人員診斷疾病時(shí)造成很大的迷惑性。因此現(xiàn)代獸醫(yī)疾病診斷要求從業(yè)人員不能再單純地依靠臨床綜合診斷方法進(jìn)行診斷，迫切要求實(shí)驗(yàn)室診斷方法與臨床綜合診斷相結(jié)合的方法，這樣的診斷方式才能夠更準(zhǔn)確。

圖3 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

另外，通過本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，常規(guī)的抗生素藥物抑菌或抗菌效率降低，啟示我們現(xiàn)在家禽養(yǎng)殖抗生素濫用現(xiàn)象層出不窮，也提示我們獸醫(yī)從業(yè)人員應(yīng)該勸導(dǎo)養(yǎng)殖人員應(yīng)該合理、穿插使用抗生素藥物，不能超過藥物的使用濃度或反復(fù)一直使用某一類抗生素。同時(shí)抗生素的頻繁使用也驚醒我們生物安全、食品安全問題的出現(xiàn)，長期地使用抗生素會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生耐藥細(xì)菌甚至超級細(xì)菌，產(chǎn)生公共安全問題。

[1]Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro∶ the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant[J].Biol.,1986,(51)∶263-273.

[2]Mullis K, Faloona F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction[J].Methods Enzymol.,1987,(155)∶335-350.

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[5]許一平.多重PCR檢測沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的研究[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.力降低重茬作物的病情指數(shù)，連年施用可大大緩解連作障礙。減少環(huán)境污染，對人、畜、環(huán)境安全、無毒，是一種環(huán)保型肥料。