王海彥，韋葉生，黃孔文，廖品琥，熊濱，李軍，黃冰，胡東海，仇曉文

（1.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，廣西 百色 533000；3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣西 南寧 530021；4.廣西醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院麻醉科，廣西 南寧 530021）

·論著·

IL-10基因啟動子區(qū)域遺傳多態(tài)性研究*

王海彥1，韋葉生2，黃孔文1，廖品琥1，熊濱3，李軍1，黃冰4，胡東海1，仇曉文1

（1.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，廣西 百色 533000；3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣西 南寧 530021；4.廣西醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院麻醉科，廣西 南寧 530021）

目的比較分析IL-10基因啟動子區(qū)域SNP等位基因和基因型在不同地區(qū)、種族之間的分布。方法使用PCR和DNA測序方法，檢測廣西地區(qū)人群IL-10基因啟動子區(qū)域rs1800871G/A、rs1800872G/T多態(tài)性，并與人類基因組計劃研究的4個人群（歐洲、中國北京、日本及非洲）以及新西蘭、丹麥及墨西哥等地區(qū)人群SNP分型數(shù)據(jù)相比較。結(jié)果rs1800871G/A、rs1800872G/T SNP的分型數(shù)據(jù)，在男性、女性組間分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。其SNP分型數(shù)據(jù)與中國北京地區(qū)、日本人群相比較，分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而與非洲、歐洲、墨西哥、丹麥及新西蘭地區(qū)人群比較，分布差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)論IL-10基因啟動子區(qū)域rs1800871G/A、rs1800872G/T多態(tài)性在不同地區(qū)、種族人群之間的分布有差異。

IL-10；多態(tài)性；基因型

白細胞介素10（interleukin 10，IL-10）是一種具有多效應功能的細胞因子，主要由T細胞亞群Th2細胞、巨噬細胞及單核細胞等合成、釋放，其通過免疫抑制及免疫刺激雙重作用，調(diào)節(jié)機體的炎癥反應與免疫反應平衡，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[1-4]。人類IL-10的基因定位于染色體1q32，其基因啟動子區(qū)域單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）影響血清IL-10的表達水平[5-6]。目前研究顯示，IL-10基因SNP與多種炎癥性疾病有關(guān)，如膿毒癥[7]、哮喘[8]及強直性脊椎炎[9]等。到目前為止，國內(nèi)外對IL-10基因單核苷酸多態(tài)性的研究主要聚焦在其與疾病的聯(lián)系上，而對其地區(qū)分布及種族人群的研究較少。本研究檢測IL-10基因啟動子區(qū)域SNP位點中的2個位點，以分析其基因型和等位基因頻率在廣西地區(qū)人群中的分布，并與人類基因組計劃研究的4個人群（歐洲、非洲、中國北京及日本）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）以及墨西哥、丹麥及新西蘭等地區(qū)人群SNP分型結(jié)果相比較，探討IL-10基因啟動子區(qū)域SNP在不同地區(qū)、種族人群之間的分布差異。

1 資料與方法

1.1研究對象

選取199例廣西地區(qū)中臨床指標和實驗室檢查均在正常范圍內(nèi)的健康體檢者。其中，男118例，女81例；平均（54.0±14.61）歲。確認無器質(zhì)性疾病，且無血緣關(guān)系。每位參與者對本試驗項目知情同意，并自愿參與。

1.2主要試劑

全血DNA提取盒（天根生化科技有限公司），PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司），蝦堿酶（Promega），外切酶Ⅰ（Epicentre），Hotstar Taq聚合酶（Qiagen），延伸反應試劑盒（SNaPshot Multiplex kit，ABI）。

1.3方法

1.3.1標本制備EDTA-K3抗凝采血管收集每位參與對象外周靜脈血2 ml，提取全血DNA，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2多態(tài)性位點基因型的分析采用本實驗室常用的單堿基延伸PCR分析方法檢測IL-10基因啟動子區(qū)域rs1800871G/A、rs1800872G/T基因型。PCR引物通過在線Primer3軟件設計（http://frodo. wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）。其中，rs1800871 G/A位點引物序列上正向為：5'-TCCCAA GCAGCCCTTCCATT-3'，反向：5'-CCAAATTCTCAGT TGGCACTGG-3′，擴增片段長度322 bp；延伸引物序列為：5'-TTTTTTTTTTTTTTCACTGGTGTACCCTT GTACAGGTGATGTAA-3'。rs1800872 G/T位點引物序列正向為：5'-TCCCAAGCAGCCCTTCCATT-3'，反向為：5'-CCAAATTCTCAGTTGGCACTGG-3'，擴增片段長度322 bp；延伸引物序列為：5'-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCA TCCTGTGACCCCGCCTGT-3'。

1.3.3PCR反應采用20μl擴增反應體系，其中包含1×HotStarTaq緩沖液、3.0 mmol/L鎂離子、多重PCR引物、HotStarTaq聚合酶、0.3 mmol/L dNTP、DNA模板。反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性15 s，65℃退火40 s，72℃延伸1 min的順序進行11個循環(huán)；然后94℃變性15 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min的順序進行24個循環(huán)，72℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物用蝦堿酶和外切酶Ⅰ純化后進行延伸反應，延伸產(chǎn)物經(jīng)純化后再用ABI3130XL測序儀進行測序。測序結(jié)果用GeneMapper4.1（Applied biosystems）進行分型分析。

1.4統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SSPS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間基因型和等位基因頻率分布情況及計數(shù)資料比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1基因型檢測結(jié)果

IL-10基因啟動子區(qū)域rs1800871G/A及rs1800872G/T兩位點的SNP分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs1800871G/A位點存在GG、GA及AA 3種基因型，見圖1；rs1800872G/T位點存在GG、GT和TT 3種基因型?；驕y序也驗證了此結(jié)果，見圖2。

2.2 SNP分型結(jié)果

本試驗所選研究對象具有群體代表性（P＞0.05），符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，能代表廣西地區(qū)人群情況，見表1、2。IL-10基因啟動子區(qū)域rs1800871G/A和rs1800872G/T兩位點基因型及等位基因頻率在男性、女性兩組間分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其中，rs1800871G/A位點以GA及AA基因型多見，以A等位基因最為常見；rs1800872G/T以GT和TT基因型多見，以T等位基因最為常見，見表3、4。

2.3不同地區(qū)、種族人群間的比較

通過比較廣西地區(qū)人群與人類基因組計劃研究的4個人群（歐洲、中國北京、日本及非洲）以及墨西哥、丹麥及新西蘭等人群SNP分型數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)IL-10基因啟動子區(qū)域的rs1800871G/A及rs1800872G/T兩位點的基因型及等位基因頻率分布與歐洲、非洲、墨西哥[10]及新西蘭[11]地區(qū)人群比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而與日本、中國北京地區(qū)人群之間的分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表5、6。

3 討論

IL-10是一種具有多效應功能、重要的免疫調(diào)節(jié)細胞因子[1-4]。其主要通過與靶細胞膜上的IL-10受體結(jié)合后激活酪氨酸激酶，從而發(fā)揮其生物學效應[12]，在機體正常生理條件下，IL-10基因表達受到嚴格調(diào)控，細胞和血漿中IL-10水平很低，在病理條件下，其表達水平增加，來調(diào)控機體的抗炎癥反應或免疫調(diào)節(jié)作用。B淋巴細胞合成IL-10可通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞之間功能的平衡，抑制對機體傷害性免疫反應，減弱細胞介導的炎癥反應，控制機體避免發(fā)生瀑布樣炎癥反應[13]。IL-10的免疫抑制作用，使其對部分抗原有免疫耐受作用，在病原體清除中起到作用，如果IL-10水平過高或者功能紊亂，可導致炎癥的形成，如膿毒癥[7]、哮喘[8]及強直性脊椎炎[9]等。研究顯示IL-10啟動子區(qū)域基因多態(tài)性可能影響基因的轉(zhuǎn)錄活性，進而可能影響其血漿表達水平[14-16]。IL-10基因rs1800871G/A和rs1800872G/T兩位點單核苷酸多態(tài)性可影響IL-10的產(chǎn)量[17]。而IL-10的產(chǎn)量可能與某些疾病起病有關(guān)，使不同人群對疾病的易感性及發(fā)病率不同。因此，研究IL-10基因SNP在不同地區(qū)、種族人群分布特點，可為臨床及免疫學研究提供資料。

通過分析廣西地區(qū)人群中IL-10啟動區(qū)的rs1800871G/A及rs1800872G/T兩位點多態(tài)性分布情況，發(fā)現(xiàn)在廣西地區(qū)正常人群中，rs1800871G/A位點以GA基因型（43.4%）、AA基因型（49.0%）多見，以A等位基因（70.7%）最為常見；rs1800872G/T以GT基因型（43.2%）、TT基因型（48.7%）多見，以T等位基因（70.4%）最為常見。分析顯示，rs1800871G/A和rs1800872G/T兩位點SNP分型在男性、女性之間的分布，其差異無統(tǒng)計學意義。在歐洲、非洲、墨西哥、丹麥及新西蘭地區(qū)人群中，rs1800871G/A和rs1800872G/T兩位點等位基因均以G最為常見，顯著高于廣西地區(qū)人群的分布頻率，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

綜上所述，對IL-10基因的rs1800871G/A和rs1800872G/T兩位點基因多態(tài)性研究，表明其基因型及等位基因在不同地區(qū)、種族人群之間存在差異，為了解影響不同地區(qū)、不同種族人群對疾病的易感性提供了生物信息學的信息。

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Study on genetic polymorphisms of interleukin 10 gene promoter region*

Hai-yan WANG1,Ye-sheng WEI2,Kong-wen HUANG1,Pin-hu LIAO1,Bin XIOANG3, Jun LI1,Bing HUANG4,Dong-hai HU1,Xiao-wen QIU1
(1.Department of Intensive Care Unit;2.Department of Clinical Laboratory,Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities,Baise,Guangxi 533000,P.R.China;3.Department of Intensive Care Unit,the People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region,Nanning, Guangxi 530021,P.R.China;4.Department of Anesthesiology,the Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University,Nanning,Guangxi 530021,P.R.China)

【Objective】To investigate the frequency of allele and genotype distribution of single nucleotide polymorphisms(SNPs)in the interleukin 10(IL-10)gene promoter region in the Guangxi population,and to analyze allelic and genotypic diversity of IL-10 gene in different geographical regions and among different races.【Methods】The polymerase chain reaction-single base extension(PCR-SBE)and DNA sequencing techniques were used to analyze the rs1800871G/A and rs1800872G/T polymorphisms at the promoter region of IL-10 in the Guangxi population.The allelic and genotypic diversity of rs1800871G/A and rs1800872G/T were compared with Hapmap-CEU, Hapmap-HCB,Hapmap-JPT and Hapmap-YRI from the Human Genome Project group(Hapmap)data base and with populations in New Zealand,Denmark and Mexico population.【Result】The diversity of rs1800871G/A and rs1800872G/T polymorphisms at the promoter region of IL-10 had no significant difference between female and male group(P＞0.05).Compared with the Hapmap-YRI,and Hapmap-CEU of the Mexicans,Denes,and New Zealan-ders,the diversity of genotypic and allelic of IL-10 were significantly different(P＜0.01).However,compared with Hapmap-JPT and Hapmap-HCB,there were no significant difference(P＞0.05).【Conclusion】The frequencies of polymorphisms distribution of rs1800871G/A and rs1800872G/T at the promoter region of IL-10 were significantly different among the different ethnic groups.

IL-10;polymorphism;genotype

R735.2

A

1005-8982（2015）28-0012-05

2015-05-21

廣西自然科學基金重點項目（No：2011GXNSFD018039）；廣西科技攻關(guān)項目，桂科攻（No：1140003B-93）；廣西教育廳科研（No：201012MS176）

廖品琥，E-mail：liaopinhu@163.com，Tel：0776-2848807