賈愛卿，王貴平，宣 華，廖 明

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；2. 廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣州 511400；3. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣州 510600）

副豬嗜血桿菌毒力因子的研究進(jìn)展

賈愛卿1，2，王貴平2，宣 華3，廖 明1

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；2. 廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣州 511400；3. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣州 510600）

目前預(yù)防和控制革拉斯氏病仍然非常困難，副豬嗜血桿菌是革拉斯氏病的病原菌，定殖于健康豬群的上呼吸道中。了解副豬嗜血桿菌的病原性對于確定其如何引起發(fā)病和更好的區(qū)分“毒力”和“非毒力”菌株是必要的。副豬嗜血桿菌感染需要粘附和入侵宿主細(xì)胞，抵抗巨噬細(xì)胞的吞噬，抵抗補(bǔ)體結(jié)合并誘發(fā)炎癥反應(yīng)。鑒定這些機(jī)制過程中的毒力因子在方法上受到一定的限制。關(guān)于副豬嗜血桿菌的發(fā)病機(jī)制的最新進(jìn)展集中在突變株的構(gòu)建，然而目前大多數(shù)的所謂的毒力因子需要進(jìn)一步鑒定。

副豬嗜血桿菌；毒力因子；革拉斯氏??；豬

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis， Hps）是巴氏桿菌屬的成員，是仔豬上呼吸道的一種常在菌［1］。Hps只感染豬，且仔豬通過出生后與母豬接觸感染該菌［2］。Hps通過上呼吸道感染，但在某種情況下，某些菌株能擴(kuò)散到肺部引起肺炎，或侵入全身組織器官，引起典型的多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎［2］，即革拉斯氏病（Glasser's disease）在過去，革氏病偶有發(fā)生，且多是應(yīng)激引起。然而，近年來規(guī)?；B(yǎng)殖和免疫抑制性疾病的出現(xiàn)導(dǎo)致豬呼吸道疾病和革氏病的發(fā)病率有所上升［2］。

Hps菌株間存在抗原異質(zhì)性和毒力的差異［3］。因此，辨別常在菌和毒力菌株是控制和診斷副豬嗜血桿菌病的關(guān)鍵，Hps毒力因子的鑒定將為新型疫苗的設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)。本文對當(dāng)前Hps的發(fā)病機(jī)理和毒力因子的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 關(guān)于副豬嗜血桿菌的發(fā)病機(jī)理

細(xì)菌的發(fā)病機(jī)理是一個(gè)多因素的過程，需要多種機(jī)制共同作用構(gòu)成感染和疾病的發(fā)生。發(fā)病機(jī)制主要包括病原菌對宿主的入侵，逃避宿主的免疫防御體系，細(xì)菌在體內(nèi)的繁殖和對組織的損傷。從功能上比較分析“毒力”和“非毒力”Hps的區(qū)別能夠鑒別幾種致病機(jī)制。Hps能通過粘附定殖和侵襲上皮細(xì)胞來引發(fā)感染［4，5］，進(jìn)而通過降解IgA來逃避先天免疫系統(tǒng)［6］，抵抗巨噬細(xì)胞的吞噬［7］和抵抗補(bǔ)體的中和［8］。Hps在宿主體內(nèi)增殖，產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致革氏病的病變特征產(chǎn)生［9］。這種炎癥引起的細(xì)胞通透性的改變和細(xì)菌入侵內(nèi)皮細(xì)胞的能力可能是腦膜炎發(fā)病的關(guān)鍵步驟［10］。

在體外，有毒Hps比鼻腔分離的無毒力的菌株形成生物膜的能力更強(qiáng)［11］。生物膜的形成可能與黏膜定殖有關(guān)，但并不是入侵機(jī)體系統(tǒng)所必須的。然而，在發(fā)生肺部感染時(shí)能夠檢測到假定生物膜形成相關(guān)同源基因（siaB、htrA、fumC、gcpE、acrR）的表達(dá)［12］。粘附和侵襲上皮細(xì)胞在副豬嗜血桿菌毒力菌株中已被證實(shí)，這可能是引起感染非常重要的第一步［4，5］。Hps能夠誘導(dǎo)caspase-3依賴性呼吸道上皮細(xì)胞凋亡，這可能有助于其對呼吸道黏膜的破壞［4］。

在肺部，巨噬細(xì)胞通過吞噬作用將無毒力的Hps清除掉。相反，毒力菌株能夠逃避肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬作用，其中一部分菌株是因?yàn)榍v膜的產(chǎn)生。在調(diào)理素抗體存在的情況下，毒力菌株變得容易被巨噬細(xì)胞吞噬和清除［7］。有Hps誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞初初始活化延遲，這有利于自身在肺部的持續(xù)增殖［9］。隨后，高水平激活巨噬細(xì)胞和大量促炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，導(dǎo)致疾病的發(fā)生［9］。

雖然有Hps進(jìn)入血液的具體機(jī)制尚不清楚，但其入侵內(nèi)皮細(xì)胞的能力在全身感染的過程中是非常重要的［13，14］。一旦有毒Hps進(jìn)入血液，細(xì)菌便能夠逃避抗體依賴性的補(bǔ)體系統(tǒng)［8］。血清抗性菌株能夠很好的抵抗血清殺菌效果，從而能夠到達(dá)全身各個(gè)部位，導(dǎo)致多發(fā)性漿膜炎和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎。盡管莢膜在血清抗性中的作用并未被確定，在缺乏補(bǔ)體調(diào)理作用的吞噬試驗(yàn)中觀察到細(xì)菌莢膜能夠抑制補(bǔ)體的沉淀［7］。有毒Hps對血管內(nèi)皮細(xì)胞的入侵或許可以解釋這些毒株通過血腦屏障引起腦膜炎的能力［13，14］。Hps誘導(dǎo)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和釋放IL-6、IL-8［4，10，13］，這些細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)和形成典型的革拉斯氏病病變過程中起重要作用。

2 副豬嗜血桿菌的假定毒力因子

2.1 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-Phosphogluconate dehydrogenase，6PGD） 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGD）在豬的鏈球菌中被認(rèn)為是一個(gè)保護(hù)性抗原［15］，F(xiàn)u等［16］鑒定出Hps的細(xì)胞壁中含有6PGD。由于重組的6PGD蛋白具有阻止HpsSH165粘附豬肺泡上皮細(xì)胞（SJPLC）的能力，推斷其參與SJPLC的粘附［16］。此外，重組的6PGD能夠誘導(dǎo)豬肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-8和IL-6，同時(shí)在小鼠具有一定的免疫原性和保護(hù)力，預(yù)示其可以作為一個(gè)潛在的疫苗抗原［16］。

2.2 脂寡糖（lipooligosaccharide， LOS） 由于重復(fù)性O(shè)抗原亞基的缺失，Hps有一個(gè)短的LPS，因此其分子被稱為脂寡糖［17，18］。Hps的LOS具有與大腸桿菌、胸膜肺炎和巴氏桿菌產(chǎn)生的LPS類似的誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子（TNF）和IL-6的能力［18］。Bouchet等［4，10］確定了從Hps Nagasakia株純化的LOS在粘附和誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)方面的部分作用。Hps的LOS能夠誘導(dǎo)豬的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（porcine brain microvascular endothelian cell，PBMEC）和初生仔豬的氣管（newborn piglet

trachea，NPTr）細(xì)胞釋放IL-8和IL-6。然而，Hps對PBMEC和NPTr細(xì)胞的粘附并不能被LOS完全阻斷提示還有其他粘附因子的存在［4，10］。一份關(guān)于LOS庚糖的研究顯示，一個(gè)完整的LOS對于血清抗性、粘附和入侵均是非常重要的，而缺失庚糖III只影響血清抗性［19］。此外，在小鼠模型中LOS的單克隆抗體能夠預(yù)防Hps的感染［20］。流感嗜血桿菌和睡眠嗜組織菌，已證實(shí)唾液酸酶對LPS的修飾與毒力相關(guān)，尤其是血清抗性方面［21，22］。細(xì)菌神經(jīng)氨酸酶能夠清除宿主的唾液酸（N-乙酰神經(jīng)氨酸和Neu5Ac）。唾液酸可作為碳源和/或氮源或可被CMP-Neu5Ac合成酶修飾（如NeuA和SiaB）通過唾液酸轉(zhuǎn)移酶LsgB被整合入LOS［23］。

Hps有神經(jīng)氨酸酶基因nanH和神經(jīng)氨酸酶活性是常見的，與菌株的臨床來源無關(guān)［24］。相反，lsgB基因主要存在于組織部位分離的Hps中，而從鼻腔分離的菌株中均未檢測到［24］。有學(xué)者在lsgB+的強(qiáng)毒參考菌株Nagasaki株的LOS中已證實(shí)唾液酸的存在［24］，推斷唾液酸在副豬嗜血桿菌發(fā)病機(jī)制中發(fā)生作用。

MOOC的出現(xiàn)與應(yīng)用，是在線教育、開放存取、互聯(lián)網(wǎng)+、社交網(wǎng)絡(luò)、自媒體平臺等諸多因素疊加發(fā)力的集中體現(xiàn)。MOOC環(huán)境下，用戶在信息需求特征、獲取條件、使用方式、利用特點(diǎn)等方面均發(fā)生了嬗變，作為知識發(fā)現(xiàn)與利用重要媒介的圖書館該何去何從，國內(nèi)圖書館界做了大量研究。本文綜合采用文獻(xiàn)計(jì)量法和主題分析法，對國內(nèi)圖書館與MOOC相關(guān)問題的研究現(xiàn)狀進(jìn)行梳理，揭示當(dāng)前研究的內(nèi)容、特點(diǎn)、存在問題及今后發(fā)展方向，以期為同類研究提供參考借鑒。

2.3 細(xì)胞致死膨脹毒素（cytolethal distending toxin，CDT） 細(xì)胞致死膨脹毒素（CDT）屬于細(xì)菌AB2型毒素家族，由3個(gè)亞基組成（CdtA、CdtB和CdtC），CdtB是毒素活性部位，CdtA和CdtC負(fù)責(zé)CDT毒素與靶細(xì)胞結(jié)合及將CdtB傳送至細(xì)胞內(nèi)［25］。已在很多革蘭氏陰性病原菌中發(fā)現(xiàn)了編碼CDT的基因［25］。CdtB是一個(gè)DNA酶，是一些由CDT介導(dǎo)細(xì)胞生長周期的哺乳動物細(xì)胞生長過程中G2-M分裂期阻滯和最終死亡所必需的［26］。

HpsSH0165基因組序列中已有兩個(gè)CDT基因簇位點(diǎn)被鑒定［27］。有文獻(xiàn)報(bào)道CDT重組蛋白具有毒素活性和在細(xì)胞生長過程中對細(xì)胞周期有阻滯作用。Zhou等［27］發(fā)現(xiàn)109株臨床分離的Hps和15株參考菌株都表達(dá)CdtB蛋白，證實(shí)CdtB與毒力無關(guān)。Zhang等［28］構(gòu)建了HpsSC096的CDT缺失突變株，發(fā)現(xiàn)SC096對血清的敏感性增加，而對豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（PUVEC）和PK15細(xì)胞的粘附和入侵能力降低了。

2.4 IgA蛋白酶（immunoglobulin A protease） 為了在呼吸道黏膜定殖，細(xì)菌必須克服IgA對宿主的保護(hù)作用，IgA主要通過抑制微生物粘附和侵襲、滅活細(xì)菌毒素和介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性參與對宿主的保護(hù)作用，IgA主要通過抑制微生物粘附和侵襲、滅活細(xì)菌毒素和介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性參與對宿主的保護(hù)。細(xì)菌IgA胞外蛋白酶可以裂解IgA，使細(xì)菌免受免疫球蛋白的攻擊［29］。Mullins等［6］在Hps培養(yǎng)物的上清中證實(shí)有豬IgA蛋白酶的活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌的細(xì)胞外絲氨酸蛋白酶（espP2）基因與流感嗜血桿菌編碼IgA蛋白酶的基因具有同源性，其表達(dá)產(chǎn)物能夠?qū)﹄嗍筇峁┮欢ǖ耐垂ザ颈Ｗo(hù)［30］。絲氨酸蛋白酶是一種自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與Pina -Pedrero等［31］報(bào)道過的BmaA5和BmaA6蛋白相似。副豬嗜血桿菌培養(yǎng)物上清中的IgA蛋白酶活性與espP2基因的相關(guān)性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.5 莢膜（capsule） Perry等［32］檢測了5型和15型副豬嗜血桿菌的莢膜組成：莢膜由一個(gè)二糖重復(fù)單元β-六磷酸葡萄糖主鏈和2，4-氨基-2，4，6-三羥基-D-吡咯半乳糖側(cè)鏈組成，側(cè)鏈在血清15型菌株中被α-Neu5R-3-α-GalNAc-1-P取代，血清5型菌株被α-Neu5R-3-α-Gal-1-P取代，其中R是指N-乙?；騈-羥基。羥乙?；窠?jīng)氨酸已被證實(shí)存在于哺乳動物中，但這是首次在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)。這些莢膜多糖的差異可能是由于Hps的血清型的不同造成的，而在LOS的多糖中從未檢測到差異［32］。雖然莢膜與毒力的相關(guān)性并不明確［33］，但毒力菌株與豬肺泡巨噬細(xì)胞共孵育后會產(chǎn)生明顯的莢膜，表明莢膜有抗吞噬的作用［7］。

在毒力菌株Nagasakia株中檢測到了假定莢膜產(chǎn)生基因capD，而在非毒力菌株SW114中并未檢測到［34］。HpsSH0165缺失capD基因后致病力消失，同時(shí)血清抗性降低［35］。其他參與多糖合成的基因（galU和gale）也參與生物膜的形成和血清抗性［36］，而這些基因與莢膜形成之間的直接關(guān)系，需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.6 菌毛（fimbria） 人們在雞胚上生長的Hps中觀察到了菌毛樣結(jié)構(gòu)［37］。HpsSH0165具有4個(gè)IV型菌毛基因，編碼主要結(jié)構(gòu)單元PilA（HAPS2013）和3個(gè)生物合成蛋白PilB、PilC和PilD（分別為HAPS2011， 2010 和 2009）［38］。血清4型副豬嗜血桿菌gx033基因組信息顯示其存在pilF基因，該基因編碼一個(gè)菌毛生物合成和穿梭運(yùn)動蛋白［39］。這些分子可能在細(xì)菌粘附過程中發(fā)揮作用，但并未被證實(shí)。

2.7 孔蛋白家族（porin family proteins） 孔蛋白形成穿過革蘭氏陰性菌外膜的跨膜通道［40］。Hps的兩個(gè)預(yù)測的孔蛋白OmpP2和OmpP5已被證實(shí)。來自不同菌株的OmpP2和OmpP5序列在預(yù)測的胞外環(huán)上呈現(xiàn)差異性［41］。OmpP2是Hps外膜上最豐富的蛋白［42］。盡管Hps的OmpP2序列高度保守，但非pina-pedrero毒力的菌株仍然經(jīng)常有基因插入，包括在預(yù)測的蛋白中多出額外的環(huán)［41，43，44］。

Zhang等［44］對SC096的OmpP2缺失突變后提高了其對血清的敏感性。這種敏感性的增加是由于提高了與IgG抗體的結(jié)合，隨后激活了補(bǔ)體經(jīng)典途徑［45］。同時(shí)對豬肺泡巨噬細(xì)胞［46］、對上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和侵襲的能力減弱［47］。然而，OmpP2缺失能夠引起Hps生長缺陷和OMP組分的改變。在OmpP2缺失株中ThyA，RfaD和Mip蛋白過表達(dá)，顯示上述蛋白與粘附有關(guān)［47］。

McVicker等［48］從Hps純化出P5（OmpA）蛋白，該蛋白與Hps的OmpP5具有同源性，但粘附屬性不同，P5不結(jié)合癌胚抗原。Hps OmpP5蛋白預(yù)測有4個(gè)超變區(qū)編碼的4個(gè)假定的表面暴露環(huán)，在不同的菌株間有所不同［41，49，50］。雖然巴氏桿菌科其他成員的OmpP5與毒力相關(guān)［51］，但Hps OmpP5缺失突變株并未表現(xiàn)出對血清敏感性或粘附，入侵上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞能力的降低［52］。然而，正如OmpP2缺失突變一樣，OmpP5基因的缺失突變也導(dǎo)致Hps的生長緩慢，并改變P5蛋白的表達(dá)［52］。

2.8 V型分泌系統(tǒng)（Type V secretion system） V型分泌系統(tǒng)由3個(gè)功能區(qū)組成：一個(gè)氨基端的前導(dǎo)肽序列（與跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)），一個(gè)載客結(jié)構(gòu)域（提供能量）和C-末端結(jié)構(gòu)域（在外膜上形成一個(gè)孔道，載客結(jié)構(gòu)域通過它伸向細(xì)胞外環(huán)境）［53］。V型分泌系統(tǒng)是不需要能量和輔助因子的參與［53］。

V型分泌蛋白家族主要包括自轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的分泌的蛋白（Va型或AT-1型），兩個(gè)伴侶分泌途徑（Vb型）和Vc型系統(tǒng)（也被稱為AT-2型）［53］。這些表面暴露蛋白參與各種與毒力相關(guān)的宿主病原體間的相互作用，例如粘附、入侵、自凝、補(bǔ)體抑制和IgA的降解［54，55］。此外，它們可以產(chǎn)生較好的抗體殺菌作用，就像已被證明的腦膜炎奈瑟球菌的粘附素NadA一樣［56］。SH0165和Nagasaki株的基因序列和蛋白質(zhì)組學(xué)分析證實(shí)Hps中存在自轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)［31，42，57，58］。

2.9 單體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋（monomericautotransporters）Pina-Pedrero等［31］通過比較3株血清5型Hps的基因組上AT-1編碼基因位點(diǎn)和它相鄰的基因，確定了6個(gè)β螺旋單體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Bma/AT-1）。其中bmaA1、 bmaA4、 bmaA5和bmaA6基因被證實(shí)在體內(nèi)表達(dá)且其重組表達(dá)的載客區(qū)域具有抗原性（而bmaA2和bmaA3被認(rèn)為是假基因）［31］。假定胞外絲氨酸蛋白酶（ESP），對應(yīng)于BmaA5/6，在感染豬的過程中發(fā)生表達(dá)［30］。豚鼠用重組EspP蛋白免疫后，對Hps的攻毒產(chǎn)生了部分保護(hù)［30］。盡管EspP蛋白可能與IgA蛋白酶的活性有關(guān)，但其具體功能尚不確定［6］。

2.10 毒力相關(guān)三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（virulence

associated trimeric autotransporters，VtaA） Hps編碼VtaA的基因構(gòu)成一個(gè)約10個(gè)重復(fù)的多基因家族，由類轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域序列的三個(gè)群（1群、2群和3群）組成［58］。這些vtaA基因編碼具有粘附域特征的假定外膜蛋白。同一基因組中有多個(gè)vtaA重復(fù)，這一現(xiàn)象被解釋為通過抗原轉(zhuǎn)換來逃避免疫系統(tǒng)的一種策略。Hps的3群vtaA基因高度保守，但是1群和2群vtaA基因主要存在于毒力菌株中。目前已通過PCR檢測vtaA基因的差異來區(qū)分潛在的Hps的毒力菌株［59］。

2010年，Olvera等［60］研究表明與毒力相關(guān)的自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白VtaA具有良好的免疫原性，并且只在感染的機(jī)體內(nèi)表達(dá)。所有自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域均具有模體和一些重復(fù)序列。這些模體和重復(fù)序列具有粘附素、紅血球凝集素和侵襲素的一些特征，在其中心，有不同的膠原樣重復(fù)拷貝。研究表明，自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與細(xì)菌的粘附、入侵和細(xì)胞毒性有關(guān)，可以介導(dǎo)生物被膜形成和血清抗性的產(chǎn)生，是病原微生物的一種重要的毒力因子。

Olvera等［60］用Hps Nagasaki株的亞致死劑量攻毒未吃初乳的仔豬血清檢測了VtaA的抗原性。VtaA1、5、6、8、9和10蛋白 （來自1群和2群）只在體內(nèi)表達(dá)并且具有抗原性。VtaA1、5、6、8、9和10的6種免疫轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的混合物能夠部分保護(hù)致死劑量的Nagasaki株的攻擊［61］。1群的兩個(gè)三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（VtaA8和VtaA9）是與抗吞噬有關(guān)的表面蛋白。大腸桿菌表達(dá)的VtaA8和VtaA9蛋白能夠延遲巨噬細(xì)胞的吞噬作用，但并不能完全抑制吞噬［62］。

有毒Hps需要多個(gè)毒力因子共同作用引起革氏病，而這些毒力因子大部分還未知。這些因子使Hps在肺部繁衍并進(jìn)一步向全身擴(kuò)散，然后細(xì)菌在漿膜表面復(fù)制，引起炎癥反應(yīng)和破壞宿主機(jī)體［17］。Hps對宿主免疫系統(tǒng)的侵襲和免疫逃逸的相關(guān)重要因子的鑒別，有助于我們對Hps致病機(jī)制的理解，并有助于我們合理的設(shè)計(jì)有效的Hps疫苗。此外，Hps毒力因子的界定將大大提高毒力和非毒力菌株的鑒別。需要更多的研究來驗(yàn)證副豬嗜血桿菌各毒力蛋白的具體作用，特別是，Hps多糖的作用需要進(jìn)一步驗(yàn)證，以確定莢膜和生物膜在發(fā)病機(jī)制中的貢獻(xiàn)。

3 毒力因子研究進(jìn)展緩慢可能的原因

以多數(shù)Hps毒力因子的研究并不確定，究其原因是受到以下所述因素的限制，使得至今只有少數(shù)幾個(gè)因子被清晰地界定為與該病原體的毒力有關(guān)［63］。

3.1 沒有一個(gè)好的動物攻毒模型 能夠在現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行攻毒試驗(yàn)是解析革拉斯氏病發(fā)病機(jī)理的一個(gè)關(guān)鍵要素。副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum）和胸膜肺炎放線桿菌Actinobacillus Pleuropneumoniae）與Hps關(guān)系密切，它們的攻毒試驗(yàn)動物模型可以通過上呼吸道途徑感染常規(guī)飼養(yǎng)的陰性豬而很容易地實(shí)現(xiàn)［64，65］。相反，用同樣的方式來建立復(fù)制革拉斯氏病的攻毒模型則不切實(shí)際，因?yàn)槟切┓椒ㄐ枰荛_特有的上呼吸道防御系統(tǒng)或使用缺失正常免疫能力的豬。已報(bào)道的攻毒模型有給SPF豬腹膜內(nèi)注射的方法［3］和給經(jīng)特殊人工接生且不喂初乳的仔豬（snatch farromed，colostrums deprived piglets）鼻內(nèi)［66］或氣管內(nèi)［3，67］接種的方法。這些對于一般的實(shí)驗(yàn)室都很難實(shí)現(xiàn)。另外許多學(xué)者選用小鼠作為模型——大概是為了克服使用豬作為模型的高成本和難操作性，但這種模型與Hps的致病性并不十分相關(guān)。Morozumi等［68］的研究表明Hps雖然能夠引起小鼠死亡，但是死亡很少，且?guī)缀鯖]有病變。

目前鑒定毒力因子一般采用“分子科赫法則（molecular Koch's postulates）”［69］，即如果懷疑這個(gè)基因是毒力關(guān)聯(lián)基因，那么敲除這個(gè)基因后所獲得的突變菌株應(yīng)該失去毒力或者毒力下降，經(jīng)回復(fù)突變后這個(gè)突變菌株的毒力又能得以完全恢復(fù)。這些法則的應(yīng)用提供了大量對許多病原菌致病機(jī)制的實(shí)質(zhì)性了解［70］。對于Hps，研究者試圖利用“分子科赫法則”確定其毒力因子時(shí)卻遇到了一大障礙，即難以進(jìn)行致病性試驗(yàn)。毫無疑問，這一障礙就是至今我們?yōu)槭裁磳ps毒力因子了解甚少的主要原因。

3.2從上呼吸道和發(fā)病豬群分離到的菌株的多樣性在Costa-Hurtado等［9］的綜述中，有許多文獻(xiàn)涉及到Hps“有毒”株、“無毒”株和臨床分離株之間的比對性研究。由于致病性篩選非常困難，這些關(guān)于潛在性的致病機(jī)制的研究不得不對來自健康豬（群）鼻腔的分離株（假設(shè)為“無毒”株）與來自病豬體內(nèi)正常情況下無菌部位的分離株（假設(shè)為“毒力”株）進(jìn)行比對，例如 Aragon等［8］進(jìn)行的對血清抗性的研究。雖然這樣的對比研究增長了我們對Hps致病機(jī)理的認(rèn)識，但這些方法仍具有明顯的局限性。在同一個(gè)體豬的上呼吸道中可能存在多個(gè)基因型/血清型的Hps（Blackall）［63］。此外，在同一個(gè)發(fā)病豬場也可分離到多個(gè)基因型/血清型［71］。在這些情況下，通過分離部位和豬群的臨床歷史，把分離菌株分為毒力株和非毒力株將導(dǎo)致一些菌株被錯(cuò)誤地分配在這兩個(gè)類別中。此外，這些菌株的遺傳背景的多樣性造成我們無法用“科赫法則”來區(qū)分這些菌株的病原性差異。

3.3 “強(qiáng)毒”菌株的毒力范圍 在進(jìn)行Hps的致病機(jī)制研究中遭遇到的最后一個(gè)問題是所有“強(qiáng)毒”分離菌的毒力變異問題。一個(gè)簡單的二分法，要么是“有毒”要么是“無毒”，并不能真正反映出野外感染和實(shí)驗(yàn)感染的復(fù)雜性。Kielstein等［3］及隨后的研究證實(shí)，“有毒”Hps分離株盡管都有毒力但程度并不相同。我們用同一窩不吃初乳的仔豬模型對比了H425和HS1387這兩個(gè)菌株［67］，盡管這兩個(gè)菌株都是“有毒”菌株，但結(jié)果卻完全不同。H425發(fā)病極快，且7只試驗(yàn)豬在4d內(nèi)死亡；而HS1387在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)還有7（7/9）只試驗(yàn)豬存活。H425組從7只仔豬的大腦中都分離到Hps，而HS1387只有1只從腦部分離到Hps。相反，HS1387組感染仔豬的腹膜炎比H425組明顯［67］。無疑，試驗(yàn)的這兩株菌都是“有毒”菌株，但卻有不同的臨床表現(xiàn)（一個(gè)豬群中出現(xiàn)的主要是急性敗血癥，而另一個(gè)是重癥腹膜炎）。這表明Hps的毒力機(jī)制，如同“有毒”和“無毒”菌株之間存在毒力差異一樣，即使在“有毒”菌株之中，也有著明顯的毒力差異。

革氏病的這種臨床癥狀多樣性也見于自然病例。絕大多數(shù)病豬表現(xiàn)為多發(fā)性漿膜炎，也可伴有輕度漿膜炎的急性敗血癥。自然病例之所以呈現(xiàn)不同的臨床表現(xiàn)可能與飼養(yǎng)員變更和農(nóng)場管理等因素有關(guān)。然而，Kielstein等［3］的研究結(jié)果清楚地表明，當(dāng)把“毒力”的概念應(yīng)用于Hps時(shí)存在很大的多樣性。

綜上所述，我們對Hps毒力機(jī)制的認(rèn)識還非常有限。目前研究革拉斯氏病的最好辦法是使用SF-pCD豬（snatch or catch-farrowed porcinecolostrum-deprived piglets）作為實(shí)驗(yàn)動物，對“有毒”菌株的毒力進(jìn)行評估；SF-pCD豬做為實(shí)驗(yàn)動物，也將有助于本領(lǐng)域取得更多更好的研究進(jìn)展。

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RESEARCH PROGRESS ON THE VIRULENCE OF HAEMOPHILUS PARASUIS

JIA Ai-qing1，2， WANG Gui-ping2， XUAN Hua3， LIAO Ming1
（1.Key Laboratory for Animal Vaccine Development， Ministry of Agriculture， College of Veterinary Medicine， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China； 2. Guangdong Haida Institute of Animal Husbandry & Veterinary， Guangzhou 511400， China； 3. Institute of Animal Health， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510600， China）

Haemophilus parasuis is the aetiological agent of Gl?sser's disease. The pathogenicity of H. parasuis is poorly characterised，and prevention and control of Gl?sser's disease continues to be challenging. Understanding the pathogenicity of H. parasuis is essential for determining how this bacterium produces disease and to better distinguish between virulent and non-virulent strains. H. parasuis infection requires adhesion to and invasion of host cells， resistance to phagocytosis by macrophages， resistance to serum complement and induction of inflammation. Identification of virulence factors involved in these mechanisms has been limited by difficulties in producing mutants in H. parasuis. Recent advances in understanding the pathogenesis of H. parasuis are due in part to the production of deletion mutants，although most of the potential virulence factors described so far require further characterisation. Data supporting the role of lipooligosaccharide， capsule formation， porin proteins， cytolethal distending toxin and trimeric autotransporters （VtaA） among other molecules in the virulence of H.parasuis have been described. This review provides an overview of the current knowledge of virulence factors of H. parasuis.

Haemophilus parasuis；virulence factors；Gl?sser's disease；swine

S852.612

A

1674-6422（2015）04-0072-09

2015-05-04

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201303034）

賈愛卿，女，博士，主要從事豬病的防控研究

廖明，E-mail: mlao@scau.edu.cn