廖芷卉，陳宏智，唐 昊，程天印

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙 410128；2.信陽農(nóng)林學(xué)院，信陽 46400）

羊源長角血蜱吸血后中腸優(yōu)勢菌群分析

廖芷卉1，陳宏智2，唐 昊1，程天印1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙 410128；2.信陽農(nóng)林學(xué)院，信陽 46400）

本研究采用PCR-DGGE技術(shù)分析長角血蜱的中腸菌群結(jié)構(gòu)。無菌條件下采集長角血蜱中腸內(nèi)容物，以細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取內(nèi)容物細(xì)菌總DNA，以通用引物擴(kuò)增制備16S rDNA V3區(qū)，DGGE電泳分離后，切膠回收、測定序列。結(jié)果表

PCR-DGGE；長角血蜱；腸道菌群

蜱是一類以吸血為生的體外寄生蟲，可對宿主造成直接和間接的危害，大量寄生可導(dǎo)致宿主貧血、消瘦和感染疫病。越來越多的研究表明，蜱類的危害與其消化道菌群關(guān)系密切，一些病原微生物在蜱中腸內(nèi)發(fā)育、繁殖［1］，一些非致病微生物能合成蜱所需的營養(yǎng)物質(zhì)［2］，并影響病原微生物的生長與繁殖［3，4］，故研究蜱中腸微生物菌群結(jié)構(gòu)對防治蜱及蜱傳病具有極大的潛在意義。

本研究采用PCR-DGGE技術(shù)分析長角血蜱中腸內(nèi)容物的菌群結(jié)構(gòu)。變形梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）創(chuàng)建于1983年，是一種專門分離長度相同或相近DNA片段的電泳技術(shù)。通過DGGE電泳，長度相同、組成不同的DNA片段停留在凝膠的不同位置，形成豐度不同的條帶，切取條帶即可克隆、測序。細(xì)菌16S rDNA具有種屬保守性，而V3區(qū)擴(kuò)增長度適于DGGE電泳，故已廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物、食品微生物等領(lǐng)域［5］。但是在蜱腸道微生物研究方面，DGGE電泳的報(bào)道鮮少。2003年，研究人員對澳大利亞篦子硬蜱腸道內(nèi)細(xì)菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了大量立克次氏體、巴爾通氏體及包柔氏螺旋體等蜱傳病原菌［6］。2008年，van Overbeek等［7］運(yùn)用DGGE技術(shù)在篦子硬蜱體內(nèi)檢測到米庫爾新埃希體、澳洲立克次氏體、沃巴赫氏菌及許多包柔氏螺旋體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 長角血蜱 2014年8月采自山東省泰安市放養(yǎng)山羊。飽血雌蜱、半飽血雌蜱、雄蜱各2只。采山羊血5 mL。

1.1.2 主要試劑與儀器 2×Easy Taq PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×TransHifi SuperMixⅠ購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、高純質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶、pMD18-T載體、E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物工程（大連）有限公司；DGGE變性梯度凝膠電泳儀系統(tǒng)購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；PCR儀購自基因有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌DNA提取 取飽血雌蜱、半飽血雌蜱、雄蜱各2只，用75%乙醇清洗表面，在超凈工作臺剪開蜱的后緣，用鑷子擠出血液于1.5mL離心管；加入無菌生理鹽水1 mL，輕輕搖勻，靜置5 min，所得渾濁液200×g離心5min，取上清液12000×g離心5min。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作，提取蜱中腸細(xì)菌基因組DNA。利用SDS-PK法提取山羊血液DNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段。

1.2.3 細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增與純化 以341f （5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和907r 5'-CCCC GTCAATTCATTTGAGTTT-3'）為引物，擴(kuò)增細(xì)菌DNA。擴(kuò)增體系：細(xì)菌DNA 2.0 μL、上下游引物（10 μmol/mL）各2.0 μL、2×EasyTaq PCR SuperMix 25.0μL、ddH2O 19.0μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30s，61.5℃退火30s，72℃延伸34s，33個循環(huán)；72℃延伸7 min。取產(chǎn)物5.0μL于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

以341fGC（5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGC GGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGA GGC AGCAG-3'）和518r（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）為引物，擴(kuò)增上述PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增體系：PCR產(chǎn)物1.0μL、上游引物（10μmol/mL）各2.0μL、2×TransHifi SuperMixⅠ25.0 μL、ddH2O 20.0 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，70℃退火30s，72℃延伸12s，20個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度下降0.5℃；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸12s，14個循環(huán)；72℃終延伸7min。取產(chǎn)物5.0μL于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 變性梯度凝膠電泳（DGGE） 以30%變性劑和60%變性劑制備30%～60%聚丙烯酰胺變性凝膠。將PCR純化物加入預(yù)熱的變性凝膠樣品孔，每樣7.0 μL，60℃、125V電泳4.0h。凝膠放入溴化乙錠染色液（純凈水400 mL、10 mg/mL溴化乙錠10.0μL）中染色20 min。

1.2.5 切膠回收與測序 切取DGGE凝膠中明顯而清晰的條帶，放入EP管中，以ddH2O沖洗3次，加入無菌生理鹽水50μL，4℃過夜；12000×g離心5min，吸取上清液，供克隆以及測序用。

取上清液4μL與pMD18-T載體1μL、Solution I 5 μL混勻，16℃條件下連接1 h。取連接產(chǎn)物10μL，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將感受態(tài)細(xì)胞涂布于含X-Gal、IPTG和氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)24h后，挑取白色菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)。高純質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。取質(zhì)粒7μL、EcoRI和XhoI各1μL、10× Buffer H 2μL、ddH2O 9μL，37℃酶切1h。酶切鑒定為陽性質(zhì)粒送生工生物工程股份有限公司測序，測定的序列通過BLAST進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR檢測結(jié)果 以341f和907r為引物，長角血蜱飽血雌成蜱、半飽血雌成蜱和雄成蜱腸道細(xì)菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增片段大小約650 bp，與預(yù)計(jì)大小一致。

以341fGC和518r為引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，得到長角血蜱的飽血雌成蜱、半飽血雌成蜱和雄成蜱腸道細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)，片段大小約為220 bp，電泳結(jié)果見圖1。

M: DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000）； 1:飽血雌蜱； 2:半飽血雌蜱；3: 雄蜱；N: 空白對照M: DNA Marker（DL2000）； 1: Engorgement female ticks；2: Feding female ticks； 3: Feding male ticks； N: Negative control

2.2 DGGE檢測結(jié)果 山羊血液、長角血蜱飽血雌成蜱、半飽血雌成蜱和雄成蜱腸道細(xì)菌16S rDNA V3區(qū) DGGE電泳結(jié)果見圖2，山羊血液中沒有菌群，H1、H2、H3、H4、H5、H7為長角血蜱飽血雌成蜱、半飽血雌成蜱和雄成蜱所共有，H6是長角血蜱飽血雌蜱獨(dú)有的優(yōu)勢條帶。

圖2 長角血蜱腸道細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)DGGE結(jié)果Fig.2 PCR-DGGE result of 16S rDNA V3of the bacteria in the midgut from H.Longicornis

2.3 DGGE 條帶回收測序結(jié)果 長角血蜱優(yōu)勢條帶序列及與GenBank數(shù)據(jù)庫的比較結(jié)果如表1。

表 1 DGGE 膠中回收條帶序列分析結(jié)果Table 1 The comparative results of DGGE bands recovered with the sequence from GenBank

長角血蜱廣泛分布于我國魯、豫、皖、蘇、臺、湘、鄂、晉、陜、黔、滇、川、藏、甘、黑、吉、遼等地，是萊姆病螺旋體、斑點(diǎn)熱立克次體、巴貝西蟲、蜱傳腦炎病毒等疾病的傳播媒介［6］，故以長角血蜱為研究對象具有一定的代表性和實(shí)用意義。

本研究結(jié)果表明，長角血蜱中腸優(yōu)勢菌共7種，分別為泛菌（Pantoea）、柯克斯氏體屬（Coxiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、綠膿桿菌（Pseudomonas

aeruginosa）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、歐文氏菌屬（Erwinia）。李春紅等［8］以細(xì)菌學(xué)方法分離到的顯核菌、葡萄球菌、微桿菌、短桿菌、干酪白喉?xiàng)U菌、芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、嗜麥芽窄食單孢菌、鞘脂桿菌、產(chǎn)堿打菌、莫拉菌屬、棒桿菌屬、蒼白桿菌屬，本研究則未發(fā)現(xiàn)。

綜合利用PCR-DGGE分析蜱類菌群結(jié)構(gòu)的相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果，筆者認(rèn)為Coxiella、Enterobacter、Pseudomonas等是多種蜱的共有菌（見表2）。和長角血蜱半飽血雌成蜱和雄成蜱相比，長角血蜱飽血雌成蜱擁有更多的優(yōu)勢菌（如H6）。測序比對顯示，H6序列屬于柯克斯氏體屬Coxiella?？驴怂故象w是Q熱病的病原體，能長期在蜱體內(nèi)存活，蜱既是傳播媒介又是儲存宿主。Node等［16］認(rèn)為柯克斯氏體可以感染40多種蜱，能通過繁殖在種群內(nèi)擴(kuò)散。

表 2 蜱種之間同種細(xì)菌的對照結(jié)果Table 2 Comparison of the same bacteria between different tick species

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ANALYSIS OF THE BACTERIA IN THE MIDGUT OF HAEMAPHYSALIS LONGICORNIS

LIAO Zhi-hui1，CHEN Hong-zhi2，TANG Hao1，CHENG Tian-yin1
（1. Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China； 2. Xinyang College of Agriculture and Forestry， Xinyang 46400， China）

The bacteria in the midgut of H.longicornis were detected with PCR-DGGE. The midgut's contents were collected under sterile conditions， and the bacterial total genomic DNA was extracted. Then the 16S rDNA V3 was amplified with universal primers， and the DNA fragements were separated with DGGE electrophoresis. The result showed that Pantoea sp， Coxiella sp， Enterobacter sp， Pseudomonas aeruginosa sp， Pseudomonas sp， Klebsiella sp， Erwinia sp were dominant bacterial groups in the midgut from engorgement female ticks，but Coxiella sp was not found in the feding female and male H.longicornis.

PCR-DGGE； Haemaphysalis longicornis； intestinal microbiota

S852.746

B

1674-6422（2015）04-0061-04

2015-03-31

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31372431）

廖芷卉，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

程天印，E-mail:hn5368@163.com

明，長角血蜱飽血雌成蜱中腸優(yōu)勢菌為泛菌屬、柯克斯氏體屬、腸桿菌屬、綠膿桿菌屬、假單胞菌屬、克雷伯氏菌屬、歐文氏菌屬，但半飽血雌成蜱和雄成蜱中腸未檢測到柯克斯氏體屬（Coxiella）。