張 曉，尹秀鳳，徐 凱，李 淑

（南京天邦生物科技有限公司生物技術(shù)研究所，南京 211102）

·簡 報(bào)·

豬圓環(huán)病毒 2 型Cap蛋白在桿狀系統(tǒng)中的表達(dá)與純化

張 曉，尹秀鳳，徐 凱，李 淑

（南京天邦生物科技有限公司生物技術(shù)研究所，南京 211102）

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）基因有兩個(gè)主要的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。其中，ORF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白核衣殼蛋白（Cap）。為了在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)Cap蛋白，本研究將重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-iel-ORF2經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至昆蟲細(xì)胞中，獲得重組桿狀病毒。經(jīng)過噬斑克隆實(shí)驗(yàn)，獲得穩(wěn)定、高效表達(dá)Cap蛋白的重組桿狀病毒，病毒滴度可達(dá)到1×109pfu/mL。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明重組Cap蛋白可與PCV2 陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)， 證明該重組蛋白具有良好的免疫活性反應(yīng)。本研究為提高PCV2滅活疫苗病毒滴度及免疫原性奠定了基礎(chǔ)。

豬圓環(huán)病毒2型；桿狀病毒；噬斑；純化

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）感染可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、繁殖障礙、“無名高熱癥”等［1］。在臨床上PCV2感染豬存在普遍的免疫抑制和免疫激活現(xiàn)象，引起其他各類疾病大規(guī)模爆發(fā)［2，3］，對養(yǎng)豬業(yè)造成很大的危害。目前對PCV2感染沒有特別有效的治療方法，以疫苗進(jìn)行預(yù)防為主。國內(nèi)已有滅活疫苗上市，但由于PCV2在細(xì)胞上增值滴度低，滅活疫苗成本高，不易純化，體外培養(yǎng)比較困難等［3，4］，給疫苗生產(chǎn)帶來了一定的困難。

昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)外源蛋白量高，抗原性好，易于培養(yǎng)且成本較低等特點(diǎn)，在多種疾病研究中得到廣泛應(yīng)用［5，6］。本研究通過對表達(dá)Cap蛋白的重組桿狀病毒的噬斑純化來提高Cap蛋白的表達(dá)量和純度，為進(jìn)一步提高亞單位疫苗的病毒滴度和免疫原性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 重組質(zhì)粒、細(xì)胞及試劑 重組穿梭質(zhì)粒Bacmidiel-ORF2、SF-9細(xì)胞、PCV2陽性血清均為南京天邦生物技術(shù)有限公司生物技術(shù)研究所制備并保存；HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG二抗購自Sigma公司；DNA Marker（DL 2000）、DNA提取試劑盒、PCR Buffer、dNTP、Taq 酶均購自TaKaRa公司；FITC標(biāo)記的葡萄球菌A蛋白購自武漢博士德生物工程有限公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖購自Bio Link公司；低分子量蛋白質(zhì)Marker購自Thermo SCIENTIFIC公司。

1.2 重組桿狀病毒的獲得 對提取的Bacmid質(zhì)粒濃度進(jìn)行測定后，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞。將培養(yǎng)在SF-900II培養(yǎng)液中的對數(shù)期昆蟲細(xì)胞（培養(yǎng)48h）接種于6孔板中，27℃溫箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至60%～70%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。首先，準(zhǔn)備兩個(gè)無菌1.5mL離心管A和B，A管加入200μL SF-900II 培養(yǎng)液和10μL脂質(zhì)體，室溫條件下充分混勻，靜置5 min；B管加入200 μL SF-900II 培養(yǎng)液和10μg Bacmid質(zhì)粒，靜置5min。將A管和B管中液體混合，室溫條件下靜置20min。用移液器吸掉6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，以SF-900II細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，吸掉培養(yǎng)液，將無菌離心管中的混合液滴加于細(xì)胞上，補(bǔ)充SF-900 II培養(yǎng)液600 μL，置于27℃溫箱中孵育5～7h。移去6孔板中的轉(zhuǎn)染混合液，加SF-900II 培養(yǎng)液3 mL，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。待細(xì)胞出現(xiàn)腫脹病變后，收集上清液，得到重組桿狀病毒。

1.3 桿狀病毒的噬斑篩選 將懸浮培養(yǎng)在SF-900II培養(yǎng)液中的對數(shù)期昆蟲細(xì)胞（培養(yǎng)48 h）用無菌離心管進(jìn)行濃縮，稀釋至5×105個(gè)/mL，并將稀釋好的昆蟲細(xì)胞接種于6孔板中，置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞長至90%以上的單層后，將培養(yǎng)基棄掉，PBS洗滌細(xì)胞3次。將重組桿狀病毒進(jìn)行10倍梯度稀釋，以1mL的接種量將10-4～10-8五個(gè)稀釋梯度接種6孔板中的昆蟲細(xì)胞，對照孔接入1 mL SF-9細(xì)胞培養(yǎng)液、27℃溫箱中孵育2～3 h后，棄掉感染液，加入3mL含有終濃度為1%低熔點(diǎn)瓊脂糖的SF-900II細(xì)胞培養(yǎng)液，室溫靜置20min。待瓊脂糖凝膠凝固后倒置于27℃溫箱中連續(xù)培養(yǎng)7d，并在3d后每天進(jìn)行觀察，看是否出現(xiàn)噬斑。

1.4 重組蛋白質(zhì)的表達(dá) 用巴氏德管和曲頸瓶挑取清澈的噬斑，將含有病毒的瓊脂糖蓋子轉(zhuǎn)入裝有1 mL SF-9細(xì)胞培養(yǎng)液的1.5mL無菌離心管中，漩渦震蕩混勻后，接種于長滿單層SF-9細(xì)胞的100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d后收獲上清液，得到純化后的重組桿狀病毒。收獲的細(xì)胞經(jīng)PBS離心洗滌3次后，以100 μL的PBS重懸細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，加入25 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸10 min后，以5%的濃縮膠和12.5%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。一塊膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色過夜后，30 min更換1次脫色液，脫色3次；另一塊膠進(jìn)行免疫印記實(shí)驗(yàn)。兩組實(shí)驗(yàn)中均以培養(yǎng)3d的未接種病毒的SF-9細(xì)胞作為對照組。

1.5 間接免疫熒光（indirect immunofluorescence assay， IFA） 測定純化效率以病毒量1%的接種濃度接種狀態(tài)良好的SF-9細(xì)胞，同時(shí)設(shè)未接種病毒的細(xì)胞為對照組。72 h后收獲感染細(xì)胞和對照組細(xì)胞，以PBS洗滌5次，冰乙醇固定30 min；加入1:200稀釋的豬圓環(huán)病毒2型陽性血清，37℃恒溫培養(yǎng)箱中放置2 h后，PBS洗滌5次，每次5 min；加入1:64稀釋葡萄球菌A蛋白，避光37℃恒溫培養(yǎng)箱中放置40 min，同樣以PBS洗滌5次，每次5 min；最后，將其以PBS重懸后滴加于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組桿狀病毒的克隆篩選結(jié)果 經(jīng)噬斑克隆，在培養(yǎng)周期d6，10-6稀釋度的病毒開始出現(xiàn)肉眼可見的白色噬斑，在光學(xué)顯微鏡下可見噬斑中細(xì)胞已經(jīng)裂解（如圖1A），而噬斑周圍細(xì)胞及正常對照組細(xì)胞則狀態(tài)良好（如圖1B）。挑取噬斑接種狀態(tài)良好的SF-9細(xì)胞，27℃溫箱中培養(yǎng)3 d即可得到1株穩(wěn)定、高效表達(dá)PCV2 Cap蛋白的重組桿狀病毒，病毒滴度達(dá)到1×109pfu/mL。

2.2 重組蛋白質(zhì)的表達(dá) 用特異性引物對挑取的6株噬斑毒進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見圖2。第3泳道的噬斑毒為PCV2 陽性，其大小為702 bp。將收集到的感染細(xì)胞體，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，在約35 kDa位置出現(xiàn)1條濃染蛋白條帶（圖3）。Western blot結(jié)果也表明在約35 kDa處存在蛋白條帶（圖4）。

圖1 噬斑（A）和正常SF-9細(xì)胞（B）Fig.1 Plaque （A） and normal SF-9 cells（B）

圖2 重組桿狀病毒的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant baculovirus

圖 3 桿狀病毒表達(dá)Cap 蛋白的 SDS-PAGE 分析Fig.3 Analysis of recombinant baculovirus expressing Cap protein by SDS-PAGE

圖 4 重組桿狀病毒表達(dá) Cap 蛋白的 Western blot 分析結(jié)果Fig.4 Analysis of the recombinant baculovirus expresting cap protein by Western blot

2.3 間接免疫熒光 重組桿狀病毒接種SF-9細(xì)胞，27℃恒溫培養(yǎng)3 d后，1000×g離心收集細(xì)胞體，以豬抗PCV2 Cap免疫血清為一抗，采用IFA對感染細(xì)胞中的Cap蛋白進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，抗體能與感染后的昆蟲細(xì)胞發(fā)生陽性反應(yīng)，且噬斑純化后重組桿狀病毒的純度及對細(xì)胞的感染力增強(qiáng)，而對照組細(xì)胞卻無陽性反應(yīng)（圖5）。結(jié)果表明，噬斑純化可提高病毒滴度。

圖 5 重組桿狀病表達(dá)Cap蛋白的間接免疫熒光檢測Fig. 5 IFA analysis of Cap protein in insect cell inoculated with recombinant baculovirus

2.4 PCV2可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)綜合癥（PMWS）［7］。自1991年該疾病在加拿大被首次報(bào)道以來［8］，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失。目前，世界范圍內(nèi)諸多機(jī)構(gòu)都在開展PCV2疫苗的研究。商品化的PCV2滅活苗2010年在中國上市。但PCV2在豬腎（PK15）細(xì)胞上的培養(yǎng)周期長，培養(yǎng)成本高且增殖滴度低等因素，給生產(chǎn)和研究帶來了一定的困難。因此，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得高效、安全、廉價(jià)的疫苗成為我國PCV2疫苗研究的方向［9，10］。

本研究以Bacmid-iel-ORF2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SF-9細(xì)胞獲得了重組桿狀病毒，并進(jìn)一步對桿狀病毒介導(dǎo)的PCV2型進(jìn)行噬斑純化，獲得了在昆蟲細(xì)胞中高效表達(dá)PCV2 Cap蛋白的重組桿狀病毒。

重組蛋白有不同程度的融合，PCV2-Cap的大小在26～42 kDa之間均為正確表達(dá)。本研究獲得的重組蛋白分子量約為35kDa，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。對重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞的效率進(jìn)行IFA，結(jié)果進(jìn)一步表明噬斑純化后重組桿狀病毒的純度和感染效率有了較為明顯的提升。獲得的Cap蛋白經(jīng)Western blot分析，結(jié)果顯示Cap蛋白可以和豬PCV2陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明表達(dá)的Cap蛋白具有良好的免疫原活性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步提高亞單位疫苗的病毒滴度和免疫原性奠定了基礎(chǔ)。

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EXPRESS ION AND PURIFICATION OF CAPSID PROTEIN OF PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 BY BACULOUIRUS

ZHANG Xiao， YIN Xiu-feng， XU Kai， LI Shu
（Biotechnology Research Institute， Nanjing Tianbang Bio-industry Co. Ltd.， Nanjing 211102， China）

The genes sequence of Porcine circovirus type 2（PCV2） has two main open reading frams（ORF）. The ORF2 gene of PCV2 is the main region encoding the structural protein-capsid protein（Cap）.In order to express capsid protein in insect cells， a recombinant baculovirus were by transfecting the recombinant plasmid- Bacmid-iel-ORF2 into insect cells with lipofectin transfection. A recombinant baculovirus was obtained which could express Cap protein stably and efficiently through the plaques cloning experiments. The virus titer could reach 1×109pfu/mL. The expressed Cap protein was analyzed in Western blot， which proved that the recombinant protein could reacted with PCV2 positive serum. This study provides the basis for the further improvement the inactivated virus titer and immunogenicity.

Porcine circovirus type 2； baculovirus； viral plaque； purification

S852.659.2

B

1674-6422（2015）04-0053-04

2015-04-07

張曉，女，碩士，主要從事動(dòng)物疾病研究

尹秀鳳，E-mail：wo881223@126.com