郝一妹，張煥容，2

（1.西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都610041；2.動物醫(yī)學四川省高等學校重點實驗室，四川 成都610041）

產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起犢牛腹瀉的重要病原菌。ETEC的致病過程是細菌依賴黏附素，在腸道內(nèi)定居、繁殖，然后釋放細菌毒素引起細胞壞死和腸道紊亂，進而導致急性腹瀉[1]。黏附素、腸毒素、溶血素等是與其致病過程有關的致病因子[2]，某些血清型也與大腸桿菌的致病性有關。國外有關于大腸桿菌的O抗原血清型與腸毒素和黏附素類型之間關系的相關研究報道。本研究檢測了分離自牦牛腹瀉樣品中的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的血清型和毒力基因攜帶情況，為牦牛源產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌病的預防和治療提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 分離自川西北甘孜州和阿壩州腹瀉牦牛糞便棉拭子的41株產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌，及參 考 菌 株SWUN4598（HlyA、HlyE）、SWUN4608（HlyE、ehxA）由西南民族大學動物醫(yī)學實驗室保存；參 考 菌 株CVCC215（K99、STa、F4）、CVCC208（STa、987P）、CVCC196（K88、astA），購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.2 引物的合成 根據(jù)相關文獻[7-8]和GenBank上已公布的序列，設計了10種毒力基因引物。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 血清型鑒定 參考O抗原血清分型鑒定方法，鑒定41株牦牛源產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的血清型。

1.4 毒力基因PCR檢測 參照文獻中PCR反應條件，優(yōu)化后對41株牦牛源ETEC的10種毒力基因進行檢測。

2 結果

2.1 血清型鑒定 玻片凝集試驗顯示41株分離細菌中，有20種不同的血清型，分別為：O1，O4，O7，O15，O22，O26，O27，O28，O34，O36，O54，O56，O57，O74，O87，O96，O110，O133和O149，其中O1和O15為主要流行的血清型，均占定型菌株的20%（8/40）。定型菌株存在一定比例的常見致病性血清型：O1（8），O15（8），O22（1），O26（1）和O36（1），常見致病性菌株比例為47.5%（19/40）。有1株未能確定血清型。

2.2 毒力基因的分布 41株牦牛源ETEC菌株均含有K99基因，攜帶astA，ehxA，HlyA，HlyE，STa基因的菌株數(shù)分別為25，23，15，5，4。LT、K88、987P和F41在這41株菌中均未檢測到。13株細菌擁有3個毒力基因，K99+astA+ehxA、K99+astA+HlyA和K99+HlyA+ehxA、K99+ehxA+STa分別有5、4、3株和1株。11株細菌有4個毒力基因，其中K99+astA+ehxA+HlyA有8株，K99+astA+HlyA+HlyE有2株，K99+ehxA+HlyA+HlyE有1株。有2株細菌有5個毒力基因，分別為K99+astA+ehxA+HlyA+HlyE和K99+astA+ehxA+HlyA+STa。

3 討論

本試驗對分離自四川甘孜州和阿壩州兩藏區(qū)牦牛腹瀉樣品中的ETEC采用O抗原血清型鑒定，結果表明，樣品中的ETEC存在多種血清型，O1和O15為主要流行的血清型。本試驗結果與文獻報道的牛源ETEC的流行血清型存在一定的相似性，也具有一定的差異性。

黏附素、腸毒素、溶血素是ETEC致病因子[3]。黏附素主要由K99、K88、987P、F41等菌毛基因編碼，其中K99的分布最為廣泛，且為牛、羊、豬等牲畜所共有[4]。本試驗中，41株ETEC中均攜帶有K99菌毛基因，未檢測到其他3種菌毛基因。溶血素基因雖為腸出血性大腸桿菌（EHEC）的靶基因之一[5]，但也存在于ETEC菌株[6]，Smith在1967年報道大腸桿菌的溶血性可遺傳轉(zhuǎn)移，試驗結果顯示，溶血性大腸桿菌的靶基因HlyA在本次鑒定的牦牛源ETEC中的攜帶率高達37%（15/41），與相關報道一致。astA基因主要分布在腸致病性大腸桿菌中[7]，在產(chǎn)志賀菌毒素大腸桿菌中有檢出[8]，但在本試驗的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌中也有檢出，且檢出比例高。本試驗對牦牛腹瀉樣品中分離的ETEC的血清型和毒力基因的研究豐富了大腸桿菌的毒力基因研究的相關資料，為進一步研究牦牛源ETEC的致病機理和防治措施提供了一定的理論依據(jù)。

[1]Nataro JP，Kaper JB.Diarrheagenic Escherichia coli[J].Clin Microbiol Rev，1988，11（1）：142-201.

[2]Patel SK，Dotson J，Allen K P，et al.Identification and molecular characterization of EatA，an autotransporter protein of enterotoxigenic Escherichia coli[J].Infect Immun，2004，72（3）：1786-1794．

[3] Nagy B，F(xiàn)ekete P Z.Enterotoxigenic Escherichia coli（ETEC）in farm animals[J].Vet Res，1999，30（2-3）：259-284.

[4]高研，李衛(wèi)芬，馬國霞.產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌主要致病因子及其致病機理的研究進展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2006，5：2-5.

[5]安微，張秀英，李蕊，等.致病性大腸桿菌毒力因子和耐藥性研究進展[J].畜牧與獸醫(yī)學報，2013，45（8）：106-109.

[6] Miyuki Fujika，kosuke kasai，Tomisato miura，et al.Rapid Diagnostic Method for the detection of Diarrheagenic Escherichia coli by Multiplex PCR[J].Jpn JInfect Dis，2009，62：476-480.

[7]Franck SM，Bosworth B T，Moon HW.Multiplex PCR for enterotoxigenic，attaching and effacing and Shiga toxinproducing Escherichia colistrains fromcalves[J].JClin Microbiology，1998，36（6）：1795-1797.

[8]Pass M A，odedra R，Batt R M.Multiplex PCRs for identification of Escherichia coli virulence gene[J].JClin Microbiology，2000，38（5）：2001-2004.