曾朝珍，張永茂，康三江，張霽紅，張 芳，張海燕

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州 730070）

高級醇又稱雜醇油，指在釀造酒的過程中由酵母分解蛋白質(zhì)、氨基酸及糖類而產(chǎn)生的有強(qiáng)烈氣味的高沸點混合物，是指三個及三個以上的一元醇類[1]。發(fā)酵酒中的高級醇主要有正丙醇、異丁醇、正丁醇、正戊醇、異戊醇、β-苯乙醇等。高級醇的種類和含量決定了發(fā)酵酒的香氣特征和口感，但過高含量的高級醇會引起劇烈頭痛，對人體健康造成危害。因此，在釀造過程中對高級醇的生成進(jìn)行適當(dāng)控制已引起了普遍關(guān)注。該文對發(fā)酵酒中高級醇形成機(jī)理、檢測方法及釀造過程影響因素進(jìn)行了較全面的綜述，以期為發(fā)酵酒生產(chǎn)中高級醇的生成控制提供理論依據(jù)。

1 高級醇的形成機(jī)理

高級醇（雜醇油）是酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其生成主要有兩條途徑：氨基酸降解代謝路徑（Ehrlich代謝機(jī)制）和糖合成代謝路徑（Harris代謝機(jī)制）[2]。因此，高級醇是由相應(yīng)的α-酮酸（可來自氨基酸或糖代謝）的脫羧作用與加氫還原作用而形成的。

1.1 氨基酸降解代謝路徑（Ehrlich代謝機(jī)制）

EHRLICH于1907年提出了高級醇的形成來自氨基酸的氧化脫氨作用[3]。該代謝機(jī)理認(rèn)為發(fā)酵基質(zhì)中的支鏈氨基酸在轉(zhuǎn)氨酶作用下脫氨基并將其轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸上形成相應(yīng)的谷氨酸和α-酮酸，α-酮酸在酮酸脫羧酶催化作用下脫羧、還原，形成比原氨基酸少一個碳的高級醇。根據(jù)此反應(yīng)機(jī)理，纈氨酸降解生成異丁醇，亮氨酸降解生成異戊醇，異亮氨酸降解生成活性戊醇（2-甲基丁醇），酪氨酸降解生成酪醇（對羥基苯乙醇），苯丙氨酸降解生成α-苯乙醇，色氨酸生成色醇等。

1.2 糖合成代謝路徑（Harris代謝機(jī)制）[1]

HARRIS于1953年研究并提出了高級醇的合成代謝途徑。酵母細(xì)胞通過用來合成高級醇的同系氨基酸的某些反應(yīng)來合成高級醇。即酵母通過糖酵解途徑形成丙酮酸，丙酮酸在乙酰羥酸合酶的作用下進(jìn)入氨基酸的生物合成途徑，在合成代謝的最后階段形成α-酮酸中間體，進(jìn)一步在相應(yīng)酶的催化作用下脫羧和還原，就可形成相應(yīng)的高級醇。

2 高級醇檢測方法的研究進(jìn)展

高級醇的分析檢測方法可分為化學(xué)分析法和儀器分析法兩大類。化學(xué)分析法主要是分光光度法，儀器分析法主要包括氣相色譜法、毛細(xì)管柱氣相色譜法、頂空固相微萃取-氣相色譜法等多種分析方法。

2.1 分光光度法

分光光度法主要是指在一定波長范圍內(nèi)測定被測物質(zhì)的吸光度值并對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。該分析方法是建立在物質(zhì)對光的選擇性吸收的基礎(chǔ)上，主要包括比色法、可見紫外分光光度法等。該方法儀器操作簡單，但存在顯色不穩(wěn)定、重現(xiàn)性差及線性關(guān)系不理想等問題。張正堯等[4]在葡萄酒中采用優(yōu)化比色法檢測雜醇油含量的實驗中對二甲氨基苯甲醛比色反應(yīng)體系提出了一個改進(jìn)方法，采用溫和水浴加熱處理改變過去常用的水浴煮沸冰水浴的處理方法。該新法操作安全，回收率高，靈敏度也較高，變異系數(shù)小，測得結(jié)果與原法無差異。張建才等[5]對比色法測定葡萄酒中雜醇油含量進(jìn)行了優(yōu)化，包括酒樣的預(yù)處理、水浴的條件、顯色劑的濃度以及稀釋劑的選擇，結(jié)果認(rèn)為酒樣經(jīng)過預(yù)處理后，顯色劑選擇質(zhì)量濃度5 g/L的對二甲胺基苯甲醛-硫酸溶液，在80 ℃水浴條件下處理30 min，稀釋劑選擇2 mL硫酸溶液，于波長520 nm處測定吸光度值。利用優(yōu)化方法得到的實驗結(jié)果靈敏度高，顯色穩(wěn)定，相關(guān)系數(shù)高于國標(biāo)中的方法。甄會英等[6]在分光光度法測定蘋果酒中高級醇的實驗中指出，標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色后在波長470 nm處有最大吸收峰，因此選擇的高級醇檢測波長為470 nm。范衍瓊[7]對分光光度法測定蒸餾酒及配制酒中雜醇油的研究表明，對二甲胺基苯甲醛-硫酸溶液質(zhì)量濃度選擇10 g/L，（1+1）硫酸溶液作稀釋劑，加熱30 min，于波長495 nm處測定吸光度值，提高了方法的穩(wěn)定性、精密度和準(zhǔn)確度。姜一飛等[8]采用了主次雙波長分光光度法測定了白酒中雜醇油的含量，結(jié)果認(rèn)為取1.00 mL酒樣加水稀釋至10.0 mL，取其中0.1 mL于10.0 mL比色管中，加水至1.00 mL后，加入0.5%香藍(lán)精溶液2.0 mL，搖勻后置于沸水浴上加熱3 min，取出待冷卻后加水至5.00mL，靜置3 min，混勻后以試劑空白為參比用20 mm比色皿分別在540 nm，600 nm雙波長條件下測定透光率，方法檢出限為0.25 μg/mL。陳麗娟等[9]在比色法測白酒中雜醇油含量方法探討研究中認(rèn)為利用比色法對白酒中雜醇油測定定量不準(zhǔn)確，不能完全準(zhǔn)確地反映各種酒中高級醇的組成和比例。朱寶平等[10]對氣相色譜法和化學(xué)法測定酒中雜醇油的方法進(jìn)行比較，認(rèn)為化學(xué)法只能測定異丁醇和異戊醇，測定的結(jié)果明顯偏低。

2.2 毛細(xì)管柱氣相色譜法

與傳統(tǒng)的填充柱氣相色譜法相比，毛細(xì)管柱氣相色譜法具有滲透性好、分析速度快、進(jìn)樣量少、總柱效高等優(yōu)點。毛細(xì)管氣相色譜使用的材質(zhì)多為石英的毛細(xì)管色譜柱，采用毛細(xì)管氣相色譜法可以直接進(jìn)樣，快速測定，干擾小，但測定程序較為復(fù)雜。凌東輝等[11]采用改性的聚乙二醇（free fatty acid phase，F(xiàn)FAP）強(qiáng)極性毛細(xì)管柱程序升溫將白酒中甲醇、異丁醇和異戊醇完全分離，檢出限為0.5～1.0 μg/mL；郝恩等[12]使用聚乙二醇色譜柱（polyethylene glycol，PEG）：30 m×0.25 mm×0.25 μm（HP19091N-133），程序升溫，分流進(jìn)樣的方式，建立了白酒中雜醇油毛細(xì)管柱氣相色譜測定法。莫國榮[13]采用程序升溫法，選用大口徑HP-INNOWAX柱，建立了毛細(xì)管氣相色譜法測定白酒中甲醇和雜醇油的方法，該方法分離效果良好，分離時間加快，提高了分析速度。蒲國強(qiáng)等[14]采用程序升溫升壓方式，選擇FFAP毛細(xì)管柱分離，氣相色譜法測定酒中甲醇、雜醇油，該方法縮短了甲醇及雜醇油分離時間，提高了檢測速度，靈敏度高。陳發(fā)河等[15]采用CP-Wax-58CB 毛細(xì)管色譜柱將白酒中的甲醇、乙酸乙酯、雜醇油與之難分離組分得以較好分離。彭清濤等[16]利用PEG20000石英毛細(xì)管柱，采用直接進(jìn)樣，氫火焰離子化檢測器檢測，對白酒中的甲醇和雜醇油同時進(jìn)行了分析測定，該方法靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度高，操作簡便。王宇[17]以乙酸正戊酯作內(nèi)標(biāo)定量，保留時間定性，建立了用FFAP毛細(xì)管色譜柱檢測酒中甲醇、雜醇油含量的方法；林玲等[18]以峰面積外標(biāo)法定量，建立了一種利用毛細(xì)管氣相色譜法精確、快速測定黃酒中高級醇的方法。

2.3 填充柱氣相色譜法

填充柱氣相色譜法以惰性氣體為載氣，根據(jù)不同物質(zhì)在固定相中的滯留時間不同，而在一定條件下具有各自特定的保留時間，以保留時間與標(biāo)準(zhǔn)比較定性，以峰高與標(biāo)準(zhǔn)比較定量分析。孫偉等[19]采用GDX-102氣相色譜玻璃填充柱直接進(jìn)樣，氫火焰光度檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）測定，建立了一種用氣相色譜法測定白酒中甲醇和雜醇油含量的分析方法；王斌等[20]以保留時間定性，環(huán)己烷作內(nèi)標(biāo)定量，采用氣相色譜法，玻璃填充柱進(jìn)行分離，氫火焰離子化檢測器檢測蒸餾酒中甲醇、雜醇油含量。該內(nèi)標(biāo)法具有準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，不受進(jìn)樣誤差對結(jié)果的影響等優(yōu)點。黃貞[21]利用保留時間定性，并以丙酸乙酯作內(nèi)標(biāo)定量，采用GDX-102不銹鋼填充柱進(jìn)行分離，氫火焰離子化檢測器檢測，測定了飲料酒中的甲醇和異丁醇、異戊醇的含量。該法分析酒中的甲醇、雜醇油具有快速、簡便、準(zhǔn)確的特點，適合于大批量樣品測定。張吉芬等[22]以酒中乙醇本身作為內(nèi)標(biāo)物，利用氣相色譜氫焰離子化檢測器線性范圍寬的特點，建立了測定酒中甲醇、雜醇油和乙酸乙酯含量的氣相色譜內(nèi)標(biāo)分析方法，該法用溶劑本身作內(nèi)標(biāo)物的氣相色譜內(nèi)標(biāo)定量方法，方法省去選擇、添加內(nèi)標(biāo)物的繁瑣操作，在一定條件下可以用于其他同類樣品的定量分析。

2.4 頂空氣相色譜法

頂空氣相色譜法是指對液體或固體中的揮發(fā)性成分進(jìn)行氣相色譜分析的一種間接測定方法，它將被分析樣品與熱力學(xué)平衡的蒸氣相置于一個密閉系統(tǒng)中進(jìn)行。劉紅河等[23]采用環(huán)氧樹脂作為固相涂層制作固相微萃?。╯olid-phase micro-extraction，SPME）裝置，建立了頂空固相微萃取-氣相色譜法測定酒精飲料中甲醇和雜醇油的方法，并對萃取條件和色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，該法簡便、快速、靈敏、精密度好，拓寬了SPME的應(yīng)用范圍；徐超一等[24]在頂空氣相色譜法分析洋酒中甲醇、雜醇油的研究中指出利用頂空進(jìn)樣器，頂部空氣進(jìn)樣中的水分含量大大低于直接進(jìn)樣的含量，因此可更好地保護(hù)色譜柱，延長色譜柱的使用壽命。該方法分析全自動化，穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確性高。

3 發(fā)酵過程中影響高級醇生成的研究進(jìn)展

3.1 發(fā)酵工藝條件對高級醇生成的影響

高級醇（雜醇油）是酵母代謝的產(chǎn)物，在酵母酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生，發(fā)酵因素影響高級醇的含量，發(fā)酵工藝決定著高級醇含量的高低。ANC N C等[25]認(rèn)為，發(fā)酵前以靜置沉淀和真空過濾方式降低氨基氮含量來減少雜醇油的生成。ARAGON P等[26]認(rèn)為，葡萄酒中雜醇油的產(chǎn)生與酵母種類、發(fā)酵溫度和澄清處理有關(guān)。BOHLSCHEID J C等[27]認(rèn)為葡萄酒發(fā)酵過程中氮源與維生素的交互作用影響雜醇油的生成。LILLY M等[28]研究表明，由于支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因表達(dá)的酵母與葡萄酒和蒸餾酒中雜醇油生成有很強(qiáng)的相關(guān)性，因此可以通過調(diào)整酵母基因表達(dá)生產(chǎn)香味濃郁的酒。MATEO J J等[29]的研究結(jié)果表明，葡萄酒發(fā)酵中隨著酵母接種量的提高，雜醇油的含量也會增多。PINAL L等[30]對蒸餾酒中的雜醇油含量影響研究表明，發(fā)酵菌種、發(fā)酵溫度、碳氮比對雜醇油影響較大，而酵母接種量、氮源（尿素和硫酸銨）等幾乎沒有影響。REDDY L V A等[31]研究發(fā)現(xiàn)在芒果酒中添加果膠酶會增加雜醇油和甲醇的生成。STAVER M等[32]研究結(jié)果表明，選擇適宜的釀酒酵母可以明顯降低雜醇油的生成量。曹云剛等[33]對汾酒發(fā)酵過程中的香氣成分進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇、正丙醇、異戊醇、異丁醇以及2,3-丁二醇在發(fā)酵前期增長較快，發(fā)酵中后期增長趨于緩慢。程顯好等[34]對不同酵母菌對白蘭地?fù)]發(fā)性成分的影響結(jié)果表明酵母菌對發(fā)酵產(chǎn)物影響很大，尤其是對酯類成分和雜醇油成分的影響，高級醇中異戊醇的產(chǎn)量較高。劉明等[35]就不同發(fā)酵工藝條件對金絲小棗酒釀造過程中高級醇生成的影響研究表明，采用熱水浸提的棗汁比果膠酶酶解浸提的棗汁發(fā)酵后高級醇生成量少，控制酵母接種量，降低發(fā)酵溫度和發(fā)酵液初始pH值可以減少高級醇生成量。馬子駿等[36]研究了草莓酒人工發(fā)酵過程中化學(xué)成分的變化，結(jié)果表明高級醇是在草莓酒主發(fā)酵過程中逐步形成的，是伴隨著酵母發(fā)酵而產(chǎn)生的副產(chǎn)物，并且與乙醇同時產(chǎn)生。孫金旭等[37]對不同酵母菌添加量對白酒中雜油醇含量的影響中指出，酵母菌的添加對雜醇油總量有一定的抑制作用，異丁醇隨酵母添加量增大而不斷增加且增加幅度較大，而正丁醇和異戊醇的含量與酵母添加量呈負(fù)相關(guān)。于濤等[38]通過對蘋果酒中雜醇油形成的影響進(jìn)行研究，單因素試驗表明，接種量、發(fā)酵溫度、初始pH值主要是通過抑制酵母的生長繁殖來影響高級醇的生成；而磷酸氫二銨添加量和糖度則主要是通過改變果汁氮源相對含量實現(xiàn)對高級醇生成的影響；響應(yīng)面分析認(rèn)為接種量、磷酸氫二銨添加量、初始pH值為主要影響因素。甄會英等[6]對巨峰葡萄酒釀造過程中高級醇生成的研究結(jié)果表明，葡萄汁中酵母濃度過高或過低都會使高級醇生成量增大，添加亮氨酸對高級醇生成量影響最為顯著，甘氨酸對高級醇生成量基本無影響。張丹[39]就發(fā)酵時間對紅棗白蘭地原料酒中雜醇油含量的影響研究結(jié)果表明，雜醇油在主發(fā)酵前期隨著酒精度的增大而增大，大約80%的雜醇油是在主發(fā)酵期間隨酵母繁殖而形成，也就是酵母在合成細(xì)胞蛋白時形成，主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇和活性戊醇，主發(fā)酵結(jié)束后雜醇油的含量幾乎不再發(fā)生變化。

3.2 可同化氮素對高級醇生成的影響

可同化氮素是指在酒精發(fā)酵中酵母優(yōu)先利用的氮源，包括銨態(tài)氮、游離α-氨基酸（除脯氨酸外）和小分子多肽。可同化氮素與高級醇的形成密切相關(guān)，在發(fā)酵液中添加可同化氮素會對發(fā)酵產(chǎn)物中雜醇油的最終形成產(chǎn)生很大的影響[40]。GARDE-CERDáN T等[41]研究了不同含量可同化氮素的添加對酒精發(fā)酵過程中香氣成分產(chǎn)生的影響，通過向氮源缺陷性菌株中添加銨鹽和不同含量的氨基酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氨基酸的添加對雜醇油含量的影響不顯著。HERNáNDEZ-ORTE P等[42]研究了可同化氮素對三種酵母菌種發(fā)酵產(chǎn)生的香氣成分的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酵母菌種是影響葡萄酒香氣成分的主要因素，銨態(tài)氮和氨基酸的添加使異戊醇的含量降低，氨基酸的添加顯著增大了葡萄酒中異丁醇的含量。HERNáNDEZ-ORTE P等[43]就添加硫酸銨對三種不同釀酒酵母菌香氣成分產(chǎn)生的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明，雜醇油的含量隨著硫酸銨的添加降低，發(fā)酵前向合成培養(yǎng)基中添加硫酸銨，雜醇油含量降低的效果更加明顯。LOSADA M M等[44]研究發(fā)現(xiàn)隨著向葡萄汁中添加的銨鹽或氨基酸含量的增加，異戊醇的含量顯著降低。TORREA D等[45]通過向葡萄發(fā)酵醪液中添加銨態(tài)氮和有機(jī)氮降低了雜醇油的含量。VIDAL E E等[46]將銨態(tài)氮添加于可同化氮素含量低的甘蔗汁中后發(fā)現(xiàn)雜醇油的含量降低。

國內(nèi)對可同化氮素添加對高級醇的影響研究較少，可同化氮素的種類單一，而且對不同含量的氮源添加對高級醇的影響趨勢研究較少。韓濤等[47]研究了α-氨基氮對啤酒發(fā)酵過程中雜醇油生成的影響，試驗結(jié)果表明，麥汁中氨基氮過高或過低都會增大啤酒中雜醇油的含量，亮氨酸對雜醇油生成的影響最為顯著，纈氨酸次之，甘氨酸的影響最小。林樸[48]研究了貴人香葡萄在成熟和發(fā)酵過程中氨基氮含量的變化情況，并進(jìn)一步分析了發(fā)酵前添加氨基氮營養(yǎng)鹽對葡萄酒發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，高級醇的生成量則隨氨基氮的增多，表現(xiàn)為先降低后升高的變化趨勢。陶樹興等[49]探討了不同氮源種類及含量對蜂蜜酒中雜醇油的影響，結(jié)果表明，銨鹽中以硫酸銨雜醇油含量最高，有機(jī)氮源以豆芽汁含量最高，但是總的來說銨鹽雜醇油含量低于有機(jī)氮源。張瑾等[50]研究可同化氮素對酒精發(fā)酵產(chǎn)生的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可同化氮質(zhì)量濃度的升高有利于生成較多的香氣成分，二次添加處理可以提高高級醇和酯類的生成量。

4 小結(jié)與展望

高級醇在酒精發(fā)酵過程中的兩條代謝途徑同時存在，但在不同菌種及發(fā)酵工藝條件下，高級醇具體以何種途徑生成的研究還需進(jìn)一步深入。另外，對發(fā)酵酒中高級醇的調(diào)控還未形成統(tǒng)一的操作規(guī)程來控制高級醇的含量。目前，人們已經(jīng)意識到高級醇在酒精發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生一些有害的結(jié)果，因此，在酒精發(fā)酵過程中全面了解高級醇的生成機(jī)制及調(diào)控技術(shù)十分重要。大力加強(qiáng)酒精發(fā)酵過程中高級醇的形成途徑及影響因素的研究，將為高級醇的調(diào)節(jié)抑制提供新的途徑或手段，具有重要的理論和應(yīng)用價值。

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