包賽依娜，李順琪，蘭義賓，潘秋紅*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083）

澀感是評(píng)價(jià)葡萄酒質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，葡萄酒中澀感來源于酒體中單寧酸與人體口腔唾液中蛋白的結(jié)合而產(chǎn)生的收斂性[1]。當(dāng)前，對(duì)葡萄酒澀感的評(píng)價(jià)主要是通過品酒師的感官品評(píng)，沒有相對(duì)客觀的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，受個(gè)體狀態(tài)、品評(píng)環(huán)境等的影響較大，同一酒樣不同批次的品評(píng)結(jié)果存在較大偏差，使得葡萄酒澀度難以被客觀分級(jí)[2-4]。如葡萄酒中糖、酸、酒精含量等可與單寧酸相互作用而影響品評(píng)者對(duì)澀感的感知，增加了感官品評(píng)的難度[4-8]；澀感的強(qiáng)弱也與酒在口中停留的時(shí)間和重復(fù)暴露的次數(shù)有關(guān)，它們可以影響樣品在嘴中的殘余和遺留[9-10]，需要一個(gè)有效的品嘗和口腔沖洗制度。因此，建立一個(gè)澀感的定量評(píng)價(jià)方法，可以在很大程度上提高葡萄酒質(zhì)量評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。

前人的研究中，利用葡萄酒樣中單寧酸與白蛋白或牛血清白蛋白等結(jié)合，分析結(jié)合能力以指示澀度變化[11]，但是單純的蛋白質(zhì)溶液體系并不能真實(shí)地反映口腔唾液環(huán)境與單寧酸發(fā)生的反應(yīng)。口腔唾液中含有大量的電解質(zhì)，離子種類和強(qiáng)度等都會(huì)對(duì)蛋白與單寧酸的結(jié)合產(chǎn)生影響[2]?？谇煌僖耗M溶液由蛋白質(zhì)、電解液等物質(zhì)組成[2]。本試驗(yàn)擬建立單寧酸與口腔唾液模擬溶液反應(yīng)體系，探究單寧酸濃度、作用時(shí)間、溫度和蛋白濃度對(duì)結(jié)合反應(yīng)的影響，建立葡萄酒澀度定量分析方法，為葡萄酒品質(zhì)評(píng)價(jià)及澀感相關(guān)的理論研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 葡萄酒樣品

試驗(yàn)所用的試材取自不同年份、不同產(chǎn)區(qū)和不同品種的葡萄酒，樣品信息如表1所示。每個(gè)樣品為750 mL，取其中50 mL用于澀度分析，剩余的用于感官品評(píng)。

表1 感官品評(píng)及澀度分析所用的葡萄酒Table 1 Wine samples for sensory evaluation and astringency analysis

1.1.2 化學(xué)試劑

氯化鉀、氯化鈉、氯化鎂（MgCl2·6H2O）、氟化鈉、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、氯化鈣（CaCl2·2H2O）和磷酸氫二鉀（K2HPO4）均為分析純：北京化學(xué)試劑公司；蛋白胨和單寧酸（分析純）：美國Sigma-Aldrich公司；實(shí)驗(yàn)室純凈水用Milli-Q（Millipore，Bedford，MA）純化水系統(tǒng)制得。

1.1.3 人體口腔模擬唾液的制備

人體口腔模擬唾液包括了電解質(zhì)溶液和蛋白質(zhì)母液兩類組分[2]。

電解質(zhì)溶液的制備：稱取1.3 g 氯化鉀，0.1 g 氯化鈉，50 mg 氯化鎂（MgCl2·6H2O），0.1 g氯化鈣（CaCl2·2H2O），25 μg 氟化鈉，27 mg 磷酸二氫鉀 和35 mg 磷酸氫二鉀，用純凈水溶解，并定容至1 L。

蛋白母液的配制：用電解質(zhì)溶液作為溶劑，配制3 g/L蛋白胨溶液即為蛋白母液。

1.1.4 單寧酸母液配制

單寧酸母液：用電解質(zhì)溶液為溶劑，配制2 g/L為單寧酸母液。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；GL-20G-II離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；XMTDA數(shù)顯調(diào)節(jié)恒溫水浴鍋：余姚市亞星儀器儀表有限公司；QL-901渦旋振蕩器：海門市貝爾儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 澀度定量評(píng)價(jià)方法建立

以口腔模擬液中的電解質(zhì)溶液為空白，對(duì)含單寧酸的電解質(zhì)溶液進(jìn)行全波長掃描，確定最大吸收峰波長。根據(jù)單寧酸與蛋白結(jié)合產(chǎn)生收斂性的原理，通過測(cè)定不同反應(yīng)組在最大吸收峰波長下的吸光度值（OD）可判斷未結(jié)合的單寧酸含量，OD值越小，表明與蛋白結(jié)合的單寧酸量越多[11-12]，澀度越強(qiáng)。

將不同體積的單寧酸母液（2 g/L）與蛋白母液（3 g/L）混合，以電解液稀釋至6 mL，使蛋白質(zhì)終質(zhì)量濃度分別為0.05 g/L、0.10 g/L、0.50 g/L、1.00 g/L、1.50 g/L，單寧酸終質(zhì)量濃度分別為0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L。每組兩個(gè)平行，分別在不同溫度（34 ℃、37 ℃、40 ℃）及不同水浴時(shí)間（0.5 h、1.0 h、2.0 h）反應(yīng)。反應(yīng)液常溫條件下離心（10 000 r/min、6 min）后，取上清液，在最大吸收峰波長下測(cè)定吸光度值。

以一定質(zhì)量濃度的單寧酸與系列質(zhì)量濃度的蛋白反應(yīng)，用蛋白質(zhì)量濃度對(duì)吸光度值作圖，獲得該質(zhì)量濃度的單寧酸下曲線斜率。用不同質(zhì)量濃度的單寧酸對(duì)其相應(yīng)的曲線斜率作圖，得到單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品澀度檢測(cè)

以樣品代替單寧酸母液，按照1.3.1步驟，與梯度蛋白溶液反應(yīng)，繪制波長330 nm處的吸光度值與蛋白質(zhì)量濃度之間的對(duì)數(shù)曲線，得到其斜率，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得到樣品的澀度值（用斜率絕對(duì)值表示）。

1.3.3 感官品評(píng)

葡萄酒品嘗、漂洗程序需要避免殘留和疲勞，這就要求品嘗者們?cè)谄穱L不同葡萄酒之前用果膠沖洗液漱口。果膠沖洗溶液用商業(yè)果膠以5 g/L的質(zhì)量濃度制備。溶液在4 ℃條件下存儲(chǔ)，感官分析之前儲(chǔ)藏時(shí)間不超過3 d[1]。

品評(píng)者為15位經(jīng)過短暫培訓(xùn)的中國農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄與葡萄酒工程專業(yè)學(xué)生（3男12女），年齡在20～22歲之間。在培訓(xùn)課中主要介紹了每個(gè)屬性的感官方法和強(qiáng)度范圍，用單寧酸配制5個(gè)澀感梯度溶液，作為訓(xùn)練樣本，讓品評(píng)者感知澀味屬性，并對(duì)澀感強(qiáng)弱進(jìn)行界定，設(shè)定為5個(gè)澀感級(jí)別分別對(duì)應(yīng)為分?jǐn)?shù)值1、2、3、4、5。這5個(gè)溶液分別為：（1）體積分?jǐn)?shù)為12%乙醇+0單寧酸；（2）體積分?jǐn)?shù)為12%乙醇+0.2 g/L單寧酸；（3）體積分?jǐn)?shù)為12%乙醇+0.4 g/L單寧酸；（4）體積分?jǐn)?shù)為12%乙醇+0.6 g/L單寧酸；（5）體積分?jǐn)?shù)為12%乙醇+0.8 g/L單寧酸。遵循先白后紅、先干后甜的順序進(jìn)行品嘗。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長的確定

為了解在口腔模擬溶液中單寧酸的最大吸收波長，對(duì)含單寧酸的電解質(zhì)溶液進(jìn)行了全波長掃描，由圖1可知，在波長330 nm處有最大吸收值。這與前人的報(bào)道有所不同，如劉彥霞等[3，13-15]采用波長280 nm測(cè)定干紅葡萄酒的澀度，分析體系為水溶液，推斷可能是模擬口腔溶液的電解質(zhì)組分導(dǎo)致單寧酸吸收峰發(fā)生偏移。在后續(xù)研究中，采用波長330 nm條件下測(cè)定反應(yīng)體系中剩余單寧酸的含量。

圖1 單寧酸-口腔模擬液體系的全波長掃描Fig.1 Full wavelength scanning of tannin-oral model solution

2.1.1 反應(yīng)溫度的確定

將不同質(zhì)量濃度（0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L）的單寧酸與1.5 g/L的蛋白胨溶液混合，分別在34 ℃、37 ℃、40 ℃反應(yīng)2 h，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同質(zhì)量濃度單寧酸與蛋白質(zhì)溶液(1.5 g/L)在不同溫度下反應(yīng)時(shí)吸光度值的變化Fig.2 Changes of absorbance values of the reaction systems containing 1.5 g/L protein solution and different concentrations of tannins at different temperature

由圖2可知，37 ℃條件下單寧酸與蛋白結(jié)合呈現(xiàn)最好的線性關(guān)系，單寧酸與吸光度值的相關(guān)系數(shù)最大（R=0.994），曲線趨勢(shì)最為穩(wěn)定，考慮37 ℃也比較接近人體口腔溫度，因此在后續(xù)研究中，反應(yīng)溫度設(shè)定在37 ℃。

2.1.2 作用時(shí)間的影響

37 ℃條件下0.5 g/L蛋白質(zhì)溶液與不同質(zhì)量濃度單寧酸（0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L）分別作用0.5 h、1.0 h和2.0 h，結(jié)果見圖3。

圖3 不同質(zhì)量濃度單寧酸與蛋白質(zhì)溶液(1.5 g/L)在不同時(shí)間下反應(yīng)時(shí)吸光度值的變化Fig.3 Changes of absorbance values of the reaction systems containing 1.5 g/L protein solution and different concentrations of tannins at different temperature

由圖3可知，0.5 h和1.0 h的曲線波動(dòng)較大，而作用時(shí)間2.0 h時(shí)，曲線呈線性且趨勢(shì)穩(wěn)定。由此推測(cè)作用時(shí)間2.0 h，單寧酸與蛋白已充分結(jié)合，綜合考慮時(shí)間利用率及完全反應(yīng)情況，將該方法的作用時(shí)間設(shè)定為2.0 h。

2.1.3 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響

葡萄酒中單寧酸含量一般為0.2～0.8 g/L[15]，普通型釀造工藝及常見葡萄品種的葡萄酒內(nèi)單寧酸含量約為0.4 g/L左右。因此本試驗(yàn)分析了0.4 g/L單寧酸與不同質(zhì)量濃度（0.05～3 g/L）蛋白的結(jié)合反應(yīng)，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，蛋白質(zhì)量濃度越大，與單寧酸結(jié)合的越多，剩余的單寧酸越少，吸光度值越小，蛋白質(zhì)量濃度與吸光度值的變化呈一定的線性關(guān)系（R=0.987）。當(dāng)少量的蛋白加入單寧酸溶液中時(shí)，蛋白質(zhì)-單寧酸相結(jié)合，形成云狀沉淀[16]。起初單寧酸質(zhì)量濃度相對(duì)于蛋白的質(zhì)量濃度要高，因此所有的蛋白質(zhì)都被一定量的單寧酸沉淀。即起始時(shí)波長330 nm處吸光度值迅速下降。然而，隨著加入蛋白量的增加，溶液中單寧酸的質(zhì)量濃度變得越來越低直到完全消失。過量的蛋白不會(huì)沉淀，吸光度值下降并與蛋白質(zhì)量濃度增加不呈線性關(guān)系。建立了蛋白質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)與吸光度值變化之間的關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R=0.992，表明用對(duì)數(shù)方程可以更好地反映蛋白與單寧酸反應(yīng)曲線。

2.2 單寧酸質(zhì)量濃度與曲線斜率之間的線性關(guān)系

單寧酸與口腔唾液蛋白結(jié)合生成收斂性物質(zhì)，人可感知到澀感[1]。蛋白與單寧酸的結(jié)合能力越強(qiáng)，則澀感越強(qiáng)。對(duì)數(shù)曲線的斜率可以反映結(jié)合能力的大小，即斜率的絕對(duì)值越大，澀感越強(qiáng)，因此，樣品澀度的相對(duì)強(qiáng)弱可以用斜率大小來衡量。

根據(jù)一定質(zhì)量濃度的單寧酸與一定質(zhì)量濃度的蛋白反應(yīng)所對(duì)應(yīng)的吸光度值，獲得對(duì)數(shù)曲線的斜率，將不同質(zhì)量濃度（0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L）單寧酸與不同質(zhì)量濃度（0、0.05 g/L、0.1 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L）蛋白反應(yīng)所得到的對(duì)數(shù)曲線斜率作圖，得到單寧酸質(zhì)量濃度與對(duì)數(shù)曲線的斜率絕對(duì)值之間的關(guān)系，結(jié)果見圖5。

圖5 對(duì)數(shù)曲線斜率絕對(duì)值與單寧酸初始質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系Fig.5 Linear relationship between the slope of the logarithmic curve and the initial concentration of tannin

由圖5可知，該曲線可作為單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于衡量樣品澀度的相對(duì)強(qiáng)弱。曲線線性回歸方程為y=0.015 4x+0.012 4，兩者的相關(guān)性R達(dá)到0.972，表明它們呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。

2.3 感官品評(píng)結(jié)果與澀度定量評(píng)價(jià)方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性

基于上述確定的反應(yīng)條件和標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析了不同年份、不同品種和不同釀造工藝生產(chǎn)的葡萄酒樣品的澀度，并進(jìn)行了感官品評(píng)，結(jié)果分別如圖6A、6B所示。除了酒樣14、15、16感官品評(píng)與定量評(píng)價(jià)沒有對(duì)應(yīng)關(guān)系之外，其他樣品感官品評(píng)的分?jǐn)?shù)越高，澀度越大，相應(yīng)的曲線斜率的絕對(duì)值越高，澀度越大，兩者的相關(guān)性結(jié)果見圖6C。由圖6C可知，21個(gè)測(cè)試樣品感官品評(píng)與澀度定量評(píng)價(jià)之間的相關(guān)系數(shù)R達(dá)到0.918，線性回歸方程為y=-0.004 7x-0.006 7，表明本研究所建立的澀度定量評(píng)價(jià)方法與感官品評(píng)結(jié)果基本相符，可用于葡萄酒澀度的定量評(píng)價(jià)。

圖6 21個(gè)酒樣澀感的感官品評(píng)(A)及澀度定量評(píng)價(jià)(B)以及二者關(guān)系(C)Fig.6 Results of sensory evaluation (A),astringency quantitative evaluation (B) and their correlation (C) for 21 wine samples

3 結(jié)論

本研究建立的葡萄酒澀度定量檢測(cè)方法為：酒樣與不同質(zhì)量濃度（0～3 g/L）蛋白在電解質(zhì)溶液中，37 ℃作用2 h，常溫條件下10 000 r/min離心6 min，上清液在330 nm波長下檢測(cè)樣品吸光度值，所得的對(duì)數(shù)曲線的斜率大小可表示澀度大小，采用該方法定量檢測(cè)澀度結(jié)果與感官品評(píng)結(jié)果基本一致，其相關(guān)性為R=0.918。相比于傳統(tǒng)的感官品評(píng)將澀度主觀分級(jí)，該方法可定量葡萄酒澀度，克服了感官品評(píng)中個(gè)體差異、感官疲勞和其他呈味物質(zhì)影響等因素造成的誤差，使分析結(jié)果更具科學(xué)性。此外，該方法也可用于大批量的酒樣澀度分析，使葡萄酒澀度分析變得快速簡(jiǎn)便，并使不同批次酒樣分析具有可比性。

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