高峰，梁新政，王元，趙天智，賀世明

(1.總參謀部警衛(wèi)局衛(wèi)生保健處,北京 100017;2.解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院神經(jīng)外科)

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·基礎(chǔ)研究·

鹽霉素聚合物顱內(nèi)局部給藥對大鼠膠質(zhì)細(xì)胞瘤的治療作用

高峰1，梁新政1，王元2，趙天智2，賀世明2

(1.總參謀部警衛(wèi)局衛(wèi)生保健處,北京 100017;2.解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院神經(jīng)外科)

[摘要]目的探討鹽霉素對大鼠9L膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞系的體內(nèi)、外生長和增殖的抑制作用。方法將鹽霉素加入體外培養(yǎng)的大鼠9L膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞系中檢測其對細(xì)胞生長、增殖活動(dòng)的影響。對40只Fisher 344大鼠行顱內(nèi)9L細(xì)胞注射，以制備載瘤大鼠模型。將鹽霉素與可生物降解的藥物基質(zhì)聚酸酐類聚合物對羧基苯氧丙烷-癸二酸共聚物(pCPP∶SA)溶解并真空干燥后塑性，制成圓形藥物聚合物顆粒。對載瘤大鼠行開顱手術(shù)，于瘤腔內(nèi)植入聚合物顆粒，以觀察鹽霉素聚合物體內(nèi)抗腫瘤效果，記錄大鼠存活時(shí)間，進(jìn)行進(jìn)一步生存分析。結(jié)果鹽霉素對9L細(xì)胞具有明顯抑制作用，并表現(xiàn)出劑量依賴性特點(diǎn)。鹽霉素聚合物顆粒具有良好生物相容性，能夠短時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定釋放鹽霉素進(jìn)入局部組織。接受鹽霉素聚合物治療的大鼠，其中位生存期較對照組顯著增加；采用30%鹽霉素比例聚合物能夠在延長大鼠生存時(shí)間的同時(shí)，降低鹽霉素的使用劑量。結(jié)論鹽霉素對9L膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大的抑制殺傷作用，采用鹽霉素聚合物腫瘤局部給藥的方式具有重大臨床潛在研究和應(yīng)用價(jià)值。

[關(guān)鍵詞]神經(jīng)膠質(zhì)瘤;抗生素類，抗腫瘤；細(xì)胞生長過程;細(xì)胞增殖；模型,動(dòng)物

腦惡性膠質(zhì)瘤是最常見的大腦原發(fā)腫瘤之一，其生長迅速、惡性程度高、侵襲能力強(qiáng)、患者預(yù)后極差[1]。近年來對惡性膠質(zhì)瘤的研究治療取得了一系列重要發(fā)展，隨著手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)和提高、放療和化療藥物的不斷改良，患者中位生存期也從9個(gè)月延長為20個(gè)月[2]。然而由于顱內(nèi)惡性膠質(zhì)瘤位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)部，血腦屏障和神經(jīng)系統(tǒng)毒性等因素限制了許多新型化療藥物的臨床使用。

作為化療藥物全身給藥的有效補(bǔ)充，顱內(nèi)局部給藥方式通過化療藥物和聚合物分子相結(jié)合的方式，對腫瘤局部進(jìn)行藥物控制釋放，從而發(fā)揮藥物的抗腫瘤效果。這種局部給藥的方式既能克服全身用藥伴隨的局部藥物濃度不足的問題，又能提高藥物作用時(shí)間，避免藥物濃度波動(dòng)[3]。

鹽霉素是一種從鏈霉菌中分離得到的羧基聚醚類離子載體藥物，以往鹽霉素主要應(yīng)用于家禽的抗球蟲病治療和反芻動(dòng)物的生長促進(jìn)劑[4]。2009年，Gupta等[5]首次發(fā)現(xiàn)了鹽霉素對乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用比常用化療藥物紫杉醇強(qiáng)約100倍以上。隨后研究也表明了鹽霉素對體外培養(yǎng)的胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞、人類肺腺癌細(xì)胞、鱗狀細(xì)胞癌等諸多腫瘤細(xì)胞系具有抑制細(xì)胞生長增殖的作用[6]。盡管目前對鹽霉素的抗腫瘤機(jī)制研究還不充分，但已有證據(jù)表明鹽霉素能夠抑制血腦屏障上表達(dá)的p-糖蛋白(p-GP)，進(jìn)而抑制腫瘤的多藥耐藥機(jī)制，最終引導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-8]。

本研究采用鹽霉素和聚合物分子結(jié)合制作藥物聚合物顆粒，研究鹽霉素對體外培養(yǎng)的大鼠膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞9L細(xì)胞系和體內(nèi)9L膠質(zhì)肉瘤大鼠的腫瘤抑制作用，為鹽霉素進(jìn)一步應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的治療提供新的方法及思路。

1材料和方法

1.1材料Fisher 344大鼠，體質(zhì)量150~200g(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，所有動(dòng)物均嚴(yán)格按照SPF標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行管理和實(shí)驗(yàn)；鹽霉素(Sigma公司)；改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，胰蛋白酶，10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素、1% L-谷氨酰胺(Gibico公司)；CCK-8試劑盒(Dojindo公司)；癸二酸(sebacic acid,SA)、1,3-雙(對羧基苯氧基)丙烷[1,3-bis(p-carboxyphenoxy) propane,CPP]、甲醇、二氯甲烷溶液(Sigma公司)。

1.2細(xì)胞系9L膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞系由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍功能神經(jīng)外科研究所提供。用含有10% 胎牛血清、80.5 u/mL青霉素、80.5 μg/mL鏈霉素、1%谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，在5%的CO2孵育箱中37 ℃恒溫、飽和濕度培養(yǎng)，2~3 d傳代。

1.3鹽霉素對9L細(xì)胞生長的抑制作用為研究鹽霉素對9L細(xì)胞生長的劑量反應(yīng)關(guān)系曲線，將處于對數(shù)生長期的9L細(xì)胞種植于96孔板中(10 000細(xì)胞/孔，100 μL/孔)，鹽霉素濃度梯度設(shè)置為0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、10.0、15.0 μmol/L，同時(shí)設(shè)有DMSO對照及無細(xì)胞調(diào)零孔，每組5個(gè)復(fù)孔。在5% CO2、飽和濕度、37 ℃孵箱中孵育24 h后，加入CCK-8試劑再孵育2 h，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于全自動(dòng)酶標(biāo)儀上，測量波長為490 nm下各孔的吸光度值。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算作圖，采用繪制鹽霉素對9L細(xì)胞的劑量反應(yīng)曲線。

1.4鹽霉素聚合物的制備將CPP和SA作為生物可降解聚合物的基質(zhì)材料(20∶80)。將甲醇、鹽霉素、pCPP∶SA(20∶80)溶解于二氯甲烷中，真空干燥2~3 h后，形成固體復(fù)合物粉末，至于-20 ℃保存。采用磨具將該復(fù)合物粉末擠壓職稱直徑3 mm、厚度1 mm、重量約3 mg的圓形鹽霉素聚合物。鹽霉素質(zhì)量比例分別為15%、30%和50%(w/w)。同時(shí)制作無鹽霉素的空白聚合物作為對照。

1.5藥物釋放檢測試驗(yàn)為了解鹽霉素聚合物的藥物釋放情況，將鹽霉素聚合物樣品至于37 ℃的1 mL PBS溶液中，并于1、3、6、9、24及48 h分別進(jìn)行藥物濃度檢測。藥物釋放濃度通過紫外光譜法分析。藥霉素濃度釋放曲線采用溶液濃度±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

1.6建立大鼠9L顱內(nèi)腫瘤模型腹腔注射氯胺酮(25 mg/mL)溶液麻醉大鼠(3 mL/kg)，沿大鼠顱頂中線做切口，將左側(cè)皮膚及腱膜組織拉向外側(cè)，在顯微鏡下于左側(cè)頂骨處鉆一個(gè)3 mm孔，位置為冠狀縫后2～3 mm，矢狀縫外側(cè)3～4 mm處。避免損傷硬膜組織。隨后將大鼠固定于立體定向儀，將1×103的9L腫瘤細(xì)胞注入大鼠腦實(shí)質(zhì)組織。確切止血后，縫合傷口并消毒。

1.7體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)為了解鹽霉素聚合物樣品對大鼠是否存在毒性作用，選取正常健康大鼠15只進(jìn)行體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)。大鼠隨機(jī)分為3組，每組5只。所有大鼠均開顱進(jìn)行置入藥霉素聚合物手術(shù)。將含有15%、30%和50%(w/w)的鹽霉素聚合物樣品分別植入大鼠顱內(nèi)。大鼠麻醉后顱頂部備皮，與上述腫瘤模型類似，在顯微鏡下于左側(cè)將大鼠于顯微鏡下左側(cè)頂骨處鉆孔。通過骨窗孔，小心打開硬膜、腦實(shí)質(zhì)，并將鹽霉素復(fù)合物置于硬膜下1mm處的腦實(shí)質(zhì)中。嚴(yán)密止血后，縫合傷口并消毒。每天連續(xù)觀察大鼠是否存在運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)系統(tǒng)毒性等其他體征，評估其局部及全身性藥物毒性反應(yīng)。連續(xù)觀察40 d后處死大鼠，收集大鼠臟器進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.8鹽霉素聚合物的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)及生存分析體內(nèi)實(shí)驗(yàn)安全性基礎(chǔ)之上，選取載瘤大鼠進(jìn)行生存分析研究。40只大鼠進(jìn)行9L細(xì)胞顱內(nèi)注射后第5天，將載瘤大鼠分為5組，分別為9L腫瘤假手術(shù)組(對照)、pCPP:SA聚合物空載體組、pCPP:SA+15%鹽霉素組、pCPP:SA+30%鹽霉素組、pCPP:SA+50%鹽霉素組，每組8只大鼠。再次打開原手術(shù)切口，無菌條件下將鹽霉素復(fù)合物放置于腫瘤瘤腔組織中。止血后縫合傷口并消毒。每天連續(xù)觀察動(dòng)物是否出現(xiàn)全身性及神經(jīng)系統(tǒng)毒性反應(yīng)，并記錄大鼠死亡時(shí)間。第70天時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，處死所有大鼠。收集并固定大鼠腦組織，行相關(guān)病理學(xué)檢查。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析(ANOVA)統(tǒng)計(jì)各組間差異的顯著性。劑量效應(yīng)曲線標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行曲線擬合。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1鹽霉素對9L細(xì)胞的抑制生長作用鹽霉素在0.1~15 μmol/L之間對9L細(xì)胞具有顯著的抑制作用，并表現(xiàn)出劑量依賴特點(diǎn)。0.5 μmol/L時(shí)即表現(xiàn)出一定抑制效果，在1.0、3.0、5.0、7.0和10.0 μmol/L時(shí)，其細(xì)胞活性分別為(80.36±25.21)%、(62.1±26.67)%、(44.14±21.38)%、(13.85±6.18)%和(1.37±0.912)%(圖1)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算得其IC50為3.508 μmol/L。

2.2鹽霉素聚合物釋放實(shí)驗(yàn)將鹽霉素以不同比例與pCPP:SA混合后得到15%、30%、50%(w/w)的聚合物顆粒。藥物濃度釋放曲線如圖2所示。聚合物藥物釋放曲線表明，約60%左右藥物在前10小時(shí)內(nèi)聚合物顆粒中快速釋放，其后釋放逐漸減緩。48 h后，pCPP:SA+15%鹽霉素組釋放量約為(56±4.7)%，pCPP:SA+30%鹽霉素組釋放量為(68±10.1)%，pCPP:SA+50%鹽霉素組釋放量為(59±8.3)%。該實(shí)驗(yàn)表明鹽霉素聚合物顆粒能夠在短時(shí)間內(nèi)釋放出主要鹽霉素物質(zhì)，同時(shí)不斷持續(xù)釋放鹽霉素至組織液中。

2.3鹽霉素聚合物顆粒在體毒性研究所有顱內(nèi)置入鹽霉素-聚合物顆粒的3組大鼠均未表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)或全身性的毒理性損傷，無體質(zhì)量減輕等其他不良反應(yīng)?？紤]到口服鹽霉素對大鼠的LD50值為50.3 mg/kg，50%鹽霉素聚合物顆粒約含有鹽霉素1.4 mg，可見鹽霉素聚合物顱內(nèi)置入對組織無毒性作用。同時(shí)聚合物基質(zhì)pCPP:SA能夠在組織中代謝降解，具有良好的生物相容性。

2.4鹽霉素聚合物體內(nèi)抗腫瘤效果及大鼠生存分析共計(jì)40只9L載瘤大鼠在腫瘤種植手術(shù)后第5天進(jìn)行了聚合物顆粒植入手術(shù)，持續(xù)觀察并進(jìn)行生存分析。空白聚合物載體組中位生存時(shí)間與腫瘤對照組無顯著差別(對照組中位生存期為13 d，pCPP:SA空聚合物載體組為13.5 d)。置入鹽霉素-聚合物顆粒的3組大鼠其生存時(shí)間較對照組顯著增加：pCPP∶SA+15%鹽霉素組中位生存期為19 d，與對照組相比,P<0.01；pCPP:SA+30%鹽霉素組中位生存期為24 d，與對照組相比,P=0.0023；pCPP∶SA+50%鹽霉素組大鼠中位生存期為25.5 d，與對照組相比,P=0.0008)。第60天實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，pCPP∶SA+15%鹽霉素組有25%大鼠存活，pCPP∶SA+30%鹽霉素組中仍有25%大鼠存活，pCPP∶SA+50%鹽霉素組中仍有37.5%大鼠存活。雖然最終生存率存在不同，但pCPP∶SA+30%鹽霉素組大鼠和pCPP∶SA+50%鹽霉素組大鼠的生存時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.6228)。采用30%鹽霉素能夠在減少鹽霉素使用劑量的同時(shí)，延長載瘤大鼠生存時(shí)間(圖3)。

組織病理學(xué)檢查表明，長時(shí)間生存大鼠其腦部未見顯著腫瘤組織。

3討論

有研究報(bào)道，鹽霉素能夠顯著降低GL261-NS和GS261-AC細(xì)胞系的細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞增殖，并通過上調(diào)caspase-3活性進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。在本研究中，我們的體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了鹽霉素能夠抑9L膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞的生長和增殖，并表現(xiàn)出劑量依賴性。

雖然已有不少研究報(bào)道指明鹽霉素具有強(qiáng)效的體外抗腫瘤效果，但鹽霉素全身給藥時(shí)可能出現(xiàn)嚴(yán)重副作用，如體質(zhì)量減輕、發(fā)育遲滯、生殖系統(tǒng)損傷等，具有一定心毒性和神經(jīng)系統(tǒng)毒性；同時(shí)由于血腦屏障中滲透性糖蛋白(p-Gp)的轉(zhuǎn)運(yùn)作用對鹽霉素的藥物分布產(chǎn)生了一定影響[8]。因此，采用傳統(tǒng)的鹽霉素全身性給藥的方式，一方面為避免出現(xiàn)嚴(yán)重副作用而難以提高給藥劑量，進(jìn)而影響血藥濃度，另一方面顱內(nèi)腫瘤局部組織也難以達(dá)到有效的藥物治療濃度。

本研究中采用可生物降解的聚酸酐類聚合物pCPP∶SA作為藥物基質(zhì)，具有很好的生物相容性和可降解性。其SA單體最終分解為CO2，CPP則主要通過腎臟和糞便途徑排出體外，無組織內(nèi)累積效應(yīng)[10]。美國FDA批準(zhǔn)允許臨床使用膠質(zhì)瘤緩釋植入劑Gliadel?Wafer即是卡莫司汀和聚酸酐分子的復(fù)合物[11]。我們的載瘤大鼠在體實(shí)驗(yàn)表明，將該聚合物與鹽霉素結(jié)合形成聚合物顆粒后，置入大鼠膠質(zhì)瘤瘤腔中，鹽霉素聚合物治療組大鼠中位生存期顯著增加，證明了鹽霉素對大鼠體內(nèi)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長增殖具有抑制作用。同時(shí)由于采用瘤腔局部給藥的方式，在提高腫瘤部位藥物有效治療濃度的同時(shí)，避免了全身性藥物副作用的產(chǎn)生。

同時(shí)，不同濃度鹽霉素聚合物顆粒與大鼠生存時(shí)間曲線也表現(xiàn)出濃度依賴關(guān)系。隨著鹽霉素濃度的提高，大鼠生存時(shí)間也不斷增加。然而通過分析30%鹽霉素和50%鹽霉素治療組的差異，鹽霉素藥物毒性反應(yīng)也隨著濃度的上升和不斷增加。因此在提高生存期的同時(shí)，不斷減少其毒副作用，是下一步探尋鹽霉素治療策略的重要內(nèi)容。

在本研究中，我們采用可生物降解的聚酸酐分子與鹽霉素結(jié)合形成聚合物顆粒，行大鼠顱內(nèi)腫瘤局部植入，證實(shí)了鹽霉素對膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大的抑制殺傷作用。而采用聚合物鹽霉素局部給藥的方式，或許能夠在提高腫瘤部位局部血藥濃度的同時(shí)，減輕全身性藥物副作用，防止膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)，延長腫瘤患者生存期。

(本文圖1~3見插圖3-2)

參考文獻(xiàn)

[1]Talibi SS,Aweid B,Aweid O,et al.Prospective therapies for high-grade glial tumours:A literature review[J].Ann Med Surg (Lond),2014,3(3):55-59.

[2]Kumthekar PU,Macrie BD,Singh SK,et al.A review of management strategies of malignant gliomas in the elderly population[J].Am J Cancer Res,2014,4(5):436-444.

[3]Lin SH,Kleinberg LR.Carmustine wafers:localized delivery of chemotherapeutic agents in CNS malignancies[J].Expert Rev Anticancer Ther,2008,8(3):343-359.

[4]Zhou S,Wang F,Wong ET,et al.Salinomycin:a novel anti-cancer agent with known anti-coccidial activities[J].Curr Med Chem,2013,20(33):4095-4101.

[5]Gupta PB,Onder TT,Jiang G,et al.Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening[J].Cell,2009,138(4):645-659.

[6]Calzolari A,Saulle E,De Angelis ML,et al.Salinomycin potentiates the cytotoxic effects of TRAIL on glioblastoma cell lines[J].PLoS One,2014,9(4):e94438.

[7]Riccioni R,Dupuis ML,Bernabei M,et al.The cancer stem cell selective inhibitor salinomycin is a p-glycoprotein inhibitor[J].Blood Cells Mol Dis,2010,45(1):86-92.

[8]Fuchs D,Daniel V,Sadeghi M,et al.Salinomycin overcomes ABC transporter-mediated multidrug and apoptosis resistance in human leukemia stem cell-like KG-1a cells[J].BiochemBiophys Res Commun,2010,394(4):1098-1104.

[9]Chen T,Yi L,Li F,et al.Salinomycin inhibits the tumor growth of glioma stem cells by selectively suppressing glioma-initiating cells[J].Mol Med Rep,2015,11(4):2407-2412.

[10] Jain JP,Modi S,Domb AJ,et al.Role of polyanhydrides as localized drug carriers[J].J Control Release,2005,103(3):541-563.

[11] Attenello FJ,Mukherjee D,Datoo G,et al.Use of Gliadel (BCNU) wafer in the surgical treatment of malignant glioma:a 10-year institutional experience[J].Ann SurgOncol,2008,15(10):2887-2893.

A treatment study of 9L gliosarcoma in rats by the local delivery of salinomycinpolymer

GaoFeng*,LiangXinzheng,WangYuan,ZhaoTianzhi,HeShiming

(*HealthDivisionofGuardBureau,GeneralStaffDepartmentofChinesePLA,Beijing100017)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the inhibition effect of salinomycin polymers on the growth and proliferation of 9L gliosarcoma cells in vitro and in vivo.MethodsSalinomycin was applied to the cultured 9L cell lines,and the growth and proliferation ability were tested 40 Fisher 344 rats were received intracranial injection of 9L cells.Polyanhydride polymers were composed with 1,3-bis(p-carboxyphenoxy) propane (CPP) and sebacic acid (pCPP∶SA),and contained salinomycin.The polymers were manufactured by mix-melt method and shaped into round pills.The polymer complexes were implanted into the tumor cavitiesin vivo on the 5th day after tumor cell injection.The rat survival time and histological characteristics were examined to compare the difference treatment condition of salinomycin polymers.ResultsSalinomycin could inhibit the growth and proliferation of 9L cells and showed a dose-dependent characteristic.The salinomycin polymers were biodegradable and could release salinomycin into the adjacent tissue in a short time.Compared with the control group,the median survival time was increased significantly in salinomycin polymers group.The 30% salinomycin polymer could increased the median survival time of rats,as well as decreased the dosage of salinomycin.ConclusionSalinomycin is an effective antitumor drug for the 9L gilosarcoma treatment.Local delivery of salinomycin polymer may be a promising method for the current clinical tumor treatment.

[Key words]Glioma;Antibiotics,antineoplastic;Cell growth processes;Cell proliferation；Models,animal

(收稿日期：2015-03-18)

Corresponding author:He Shiming，Email:hshimin@fmmu.edu.cn

中圖分類號：R739.41；R979.14

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.03.022

通信作者：賀世明，博士，主任醫(yī)師，Email:hshimin@fmmu.edu.cn

作者簡介：高峰，主任醫(yī)師，Email：luckygf2004@163.com