張春艷，郭大偉，宋玲，劉文，于江波，袁曉

山東省青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)療中心，山東青島266071

人牙周膜成纖維細(xì)胞的生物力學(xué)研究

張春艷，郭大偉，宋玲，劉文，于江波，袁曉

山東省青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)療中心，山東青島266071

人牙周膜成纖維細(xì)胞是牙周膜中的主要細(xì)胞，參與調(diào)節(jié)牙周組織的改建和再生。臨床上咬合創(chuàng)傷、正畸治療及各種修復(fù)體行使功能時，各種作用力通過牙體傳遞到牙周，引起牙周膜的一系列生物學(xué)改變。因而作為牙周膜的主要功能細(xì)胞—牙周膜成纖維細(xì)胞（Human Periodontal liqament Fibroblasts，hPDLFs）的體外生物力學(xué)研究，對臨床治療起著重要的指導(dǎo)意義。該研究從hpDLFs的生長特征、蛋白質(zhì)合成、標(biāo)志性酶及細(xì)胞因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面對目前的hpDLfs的生物力學(xué)研究做一綜述。

牙周膜成纖維細(xì)胞；生物力學(xué)；研究

人牙周膜成纖維細(xì)胞是牙周膜中的主要細(xì)胞，該細(xì)胞具有合成降解膠原，受誘導(dǎo)多向分化的能力，而且還通過合成分泌多種因子與酶,參與調(diào)節(jié)牙周組織的改建和再生。臨床上咬合創(chuàng)傷、正畸治療及各種修復(fù)體行使功能時，各種作用力通過牙體傳遞到牙周，引起牙周膜的一系列生物學(xué)改變。因而作為牙周膜的主要功能細(xì)胞—牙周膜成纖維細(xì)胞（Human Periodontal liqament Fibroblasts，hPDLFs）的體外生物力學(xué)研究，對臨床治療起著重要的指導(dǎo)意義。該研究從hpDLFs的生長特征、蛋白質(zhì)合成、標(biāo)志性酶及細(xì)胞因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面對目前的hpDLfs的生物力學(xué)研究做一綜述。

1 hPDLFs的生長增值

加載裝置的不同、應(yīng)用大小、應(yīng)力頻率的不同，hPDLFs增殖活性的改變也不盡相同。王永等[1]對hPDLFs施加機(jī)械牽張力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一定力值范圍的機(jī)械張力能促進(jìn)hPDLFs增殖活性，過大力值的牽張力反而抑制細(xì)胞增殖。周繼祥等[2]利用自行設(shè)計的膜式動態(tài)張應(yīng)力-體外細(xì)胞研究體系對hPDLFs分別進(jìn)行靜張應(yīng)力及不同頻動范圍動態(tài)張應(yīng)力加載，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同張應(yīng)力對hPDLFs的增值活性影響明顯不同，靜張應(yīng)力有明顯的促hPDLFs增值作用而動態(tài)張應(yīng)力有一定的抑制作用。體外加力時間的不同[3]，同樣也影響到細(xì)胞的增殖，在一定時間范圍內(nèi)，周期性張應(yīng)力可促進(jìn)hPDLFs的增殖，但隨著時間的延長，增殖會受到抑制。在眾多研究中，加力方式、加力大小、加力時間的不同，均會引起hPDLFs增殖或抑制等不同的變化，牙周膜受力的復(fù)雜性決定了體外模擬實(shí)驗的多樣性。

2 hPDLFs膠原纖維及蛋白質(zhì)合成

人牙周膜成纖維細(xì)胞具有合成、分泌膠原蛋白功能，其膠原纖維合成情況可以反映牙周膜細(xì)胞外基質(zhì)的新陳代謝。Howard等[4]研究發(fā)現(xiàn)5%的拉伸應(yīng)變條件下，I型膠原合成增加而10%應(yīng)變則無明顯影響，說明hPDLFs對不同的機(jī)械力刺激產(chǎn)生不同的反應(yīng)，從而影響了細(xì)胞外基質(zhì)的合成，以適應(yīng)外力的刺激。同樣趙志河[5]研究發(fā)現(xiàn)不同頻動范圍的動態(tài)張應(yīng)力對hPDLFs膠原纖維合成的影響截然不同，適當(dāng)頻動范圍的動態(tài)張應(yīng)力更有效的促進(jìn)膠原纖維的合成而靜態(tài)張應(yīng)力作用并不能增加hPDLFs的膠原纖維合成。2種作用力對膠原纖維合成影響差異可能是導(dǎo)致細(xì)胞形變的不同引起的[6]。對體外培養(yǎng)的hPDLFs施以動態(tài)張應(yīng)力，較小的張應(yīng)力使hPDLFs纖連蛋白mRNA表達(dá)隨加力時間延長逐漸增加，較大張應(yīng)力使hPDLFs纖連蛋白表達(dá)先增加后減少[7]。體內(nèi)環(huán)境下膠原纖維和蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，hPDLFs受力時，細(xì)胞外基質(zhì)會產(chǎn)生相應(yīng)的破壞和改建，并通過膜蛋白傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)。

3 hPDLFs的細(xì)胞因子及酶

堿性磷酸酶（alkalline phosphates,ALP）是參與骨組織鈣化過程中關(guān)鍵性蛋白酶。Alp活性較高則表示該組織具有較強(qiáng)的鈣化及成骨功能。PDLFs具有較高水平的ALP活性，其堿性磷酸酶活性是牙齦成纖維的10倍。Yamaguchi M[8]等研究發(fā)現(xiàn)人牙周膜細(xì)胞在在同期性外力的作用下（24%elongation），ALP活動顯著降低，并且發(fā)現(xiàn)ALP活性的降低主要靠PGE2和IL-1調(diào)節(jié)的。張宇[9]等利用液壓加載系統(tǒng)對hPDLFs施加壓力發(fā)現(xiàn)，hPDLFs對壓力具有一定的耐受性，但當(dāng)壓力增加到一定程度時，隨著作用時間延長造成ALP活性降低，壓力較大會短時間內(nèi)造成ALP活性降低運(yùn)以說明過大的咬合力或矯治力，將會影響ALP活性降低，影響牙周組織鈣化，并導(dǎo)致牙周組織的一系列病變。

牙周膜細(xì)胞是具有異質(zhì)性的細(xì)胞群，受到刺激或加入某些誘導(dǎo)條件下，細(xì)胞會分化成具有成骨特性的細(xì)胞，從而引起牙槽骨的吸收和形成。hPDLFs是正畸牙移動過程中受力的直接效應(yīng)細(xì)胞，因而在牙槽骨改建中起著關(guān)鍵的作用。骨橋蛋白（osteopontin,OPN）是基質(zhì)礦化的調(diào)節(jié)基因，OPNmRNA在成骨細(xì)胞分化的早期即開始表達(dá)，可以作為成骨樣細(xì)胞分化的早期標(biāo)志。骨鈣素(osteo calcin,OC)是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，它是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)，hPDLFs在受到機(jī)械牽張力刺激作用下，OPN和OC均增殖，提示hPDLFs在機(jī)械力誘導(dǎo)下向成骨樣細(xì)胞分化，從而在機(jī)械力介導(dǎo)的牙槽骨改建中發(fā)揮重要的作用[10-11]。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMP）是一類水解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶家族。MMP通過降解膠原而參與牙周組織的力學(xué)改建。彭庭莉[12]等對hPDLFs施加動態(tài)張應(yīng)力，觀察其MMP的分泌情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hPDLFs受到動態(tài)張應(yīng)力作用后MMP-9表達(dá)有不同程度的增加，當(dāng)細(xì)胞受到5KpaN-0-N5Kpa動態(tài)作用力后表達(dá)明顯增加。該結(jié)果提示，恰當(dāng)?shù)膹垜?yīng)力作用可以明顯促進(jìn)MMP-9生成，從而加速牙周膜的改進(jìn)，這對臨床選擇最適矯治力提供了可靠的依據(jù)。MMP-2能降解IV型膠原纖維，該纖維是基底細(xì)胞膜的主要成分。正畸過程中，牙周組織吸收和重建，MMP-2起著重要的作用。對hPDLFs施加持續(xù)機(jī)械張應(yīng)力可誘導(dǎo)MMP-2表達(dá)的增加，從而影響牙周細(xì)胞外基質(zhì)的代謝[13]。

在機(jī)械力刺激下，hPDLFs能夠合成并分泌多種細(xì)胞因子，從而調(diào)節(jié)參與了牙周組織的改建和修復(fù)。TGF-β1作為損傷修復(fù)過程中的重要生物介質(zhì)，對牙周軟硬組織再生修復(fù)都有重要作用。TGF-β1能促進(jìn)hPDLFs的增殖，能促進(jìn)蛋白質(zhì)和RNA的合成[14]，還能促進(jìn)hPDLFs產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，因而研究外力作用對hPDLFs的TGF-β1表達(dá)的影響，具有極其重要的意義。湯楚華等[15]采用液壓細(xì)胞加載裝置對hPDLFs施加不同等級的壓力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hPDLFs合成TGF-β1受到機(jī)械壓力的調(diào)控，在一定載荷范圍內(nèi)，hPDLFs合成TGF-β1量隨著壓力增大而降低。該研究提示機(jī)械壓力可能通過對hPDLFs的TGF-β1表達(dá)的影響，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程，從而引起牙周組織的改建。Kimoto S[16]等應(yīng)用Flexercell細(xì)胞拉伸裝置，對hPDLFs施加5%的拉伸應(yīng)變，每分鐘3次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)恒牙來源的hPDLFs的TGF-β1合成顯著增多hPDLFs，表明hPDLFs在外力作用下通過合成分泌細(xì)胞因子的參與了牙周組織的改建。

4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

無論在臨床正畸過程中還是咬合創(chuàng)傷時，外力的刺激傳導(dǎo)到牙周膜的hPDLFs，引起牙周膜的一系列改建。力學(xué)信號是如何傳導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞呢？這就涉及到機(jī)械力學(xué)信號傳導(dǎo)路徑的問題。多種生物化學(xué)信號參與了正畸力下牙槽骨改建。

絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)（mitogen actirated protein Kinase,MAPK）是細(xì)胞內(nèi)主要的傳導(dǎo)系統(tǒng)。MAPK信號傳導(dǎo)系統(tǒng)有多條信號通道，p38MAPK是比較經(jīng)典的一條。當(dāng)受到外界刺激時，細(xì)胞內(nèi)p38MAPK由非磷酸化轉(zhuǎn)為磷酸化狀態(tài)而活化，它可促進(jìn)下游底物的磷酸化來快速實(shí)現(xiàn)信號的傳遞，也可以通過轉(zhuǎn)位入胞核活化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控特殊基因的表達(dá)，從而將信號從胞外傳導(dǎo)到胞核。黨平等[17]應(yīng)用可控壓力細(xì)胞加載裝置，觀察壓力作用下hPDLFs內(nèi)p38MAPK激活的強(qiáng)度變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)壓力值為200 Kpa時，細(xì)胞內(nèi)p38MAPK磷酸化程度明顯增強(qiáng)，約60min后磷酸化水平降至刺激前水平，初步證明機(jī)械力信號可通過跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)激活p38MAPK，引起牙周膜細(xì)胞

功能改變，導(dǎo)致牙周組織改建。對hPDLFs施加周期性張應(yīng)力時發(fā)現(xiàn)，加入p38MAPK特異性抑制劑可抑制hPDLFs細(xì)胞增殖，并能抑制周期性張應(yīng)力引起的增殖細(xì)胞核抗原mRNA的表達(dá)，證明p38MAPK信號通道在周期性張應(yīng)力介導(dǎo)的hPDLFs增殖中發(fā)揮重要的作用[4]。

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK（extracellular sigal-regulated kinase）信號通路是另一條重要的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Kook SH等研究發(fā)現(xiàn)機(jī)械力通過促進(jìn)骨保護(hù)素的產(chǎn)生而抑制hPDLFs向破骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，ERK信號通路參與其中[18]。ERK1/2是ERK的活性形式，可進(jìn)入細(xì)胞核，通過磷酸化活化轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細(xì)胞增殖和分化。有研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2信號通路介導(dǎo)機(jī)械力作用下hPDLFs的增殖調(diào)控及促進(jìn)BMP-2的表達(dá)[19]。

RAS同源基因(Ras homologgene,Rho)是細(xì)胞骨架的主要組成成分，可以調(diào)節(jié)肌動蛋白應(yīng)力纖維，通過激活Rho相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶等一系列反應(yīng)，在應(yīng)力介導(dǎo)hPDLFs細(xì)胞骨架重排中發(fā)揮作用。hPDLFs受到正畸力的作用后，會發(fā)生細(xì)胞骨架的重排和轉(zhuǎn)移，從而對應(yīng)力產(chǎn)生反應(yīng)。Rock是Rho家族的下游信號分子，研究發(fā)現(xiàn)[20]，周期性張應(yīng)力作用下ROCK蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，Rock的特異性抑制劑可以降低其表達(dá)和細(xì)胞骨架的重排，從而推斷周期性張應(yīng)力促進(jìn)細(xì)胞骨架的重排中Rho信號通路參與了此過程。

磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB或Akt）信號通路是調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。PI3K與相應(yīng)的配體（如生長因子）結(jié)合后能發(fā)生自身酪氨酸殘基的磷酸化，能磷酸化細(xì)胞膜上的PKB，激活A(yù)kt,調(diào)控許多細(xì)胞與細(xì)胞代謝、凋亡、增殖有關(guān)的蛋白，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)[21]PI3K/Akt信號通路參與了張應(yīng)力介導(dǎo)的hPDLFs細(xì)胞的凋亡。

總之，hPDLFs的體外生物力學(xué)研究雖有大量的報道，但由于多方面的原因，出現(xiàn)的結(jié)果不盡相同。比如，在細(xì)胞的來源方面，有利用組織塊法培養(yǎng)的牙周膜細(xì)胞，有的是酶消化法培養(yǎng)的，還有的利用傳代的牙周膜成纖維細(xì)胞珠。細(xì)胞加載裝置也不盡相同，所以施力的標(biāo)準(zhǔn)不同，施力的方式不同，研究結(jié)果自然有一定的差異。該研究認(rèn)為應(yīng)選用最具有代表性的細(xì)胞株來研究，選用與臨床上合力或正畸力最接近的力學(xué)加載裝置，研究的結(jié)果才更有利用價值。

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R78

A

1672-5654（2015）08（c）-0195-04

10.16659/j.cnki.1672-5654.2015.24.195

2015-05-25）

張春艷（1977.9-），女，山東青島人，碩士學(xué)位。

袁曉，男，博士后，主任醫(yī)師。