張世敏，李 翔，謝復煒，謝劍平

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

卷煙煙氣是一種復雜的混合物，已報道的化學成分超過8 000 種，并且部分化學成分顯示出一定的氧化性［1-4］。當細胞或組織暴露在卷煙煙氣中時，細胞體系的氧化/抗氧化平衡被打破，細胞產(chǎn)生氧化應激以及炎癥反應，并最終導致機體產(chǎn)生病理性損傷［5-6］。流行病學研究表明，吸煙可能與呼吸系統(tǒng)相關疾病的發(fā)生有關，如COPD（慢性阻塞性肺病）、肺癌、動脈硬化等［7-8］。有研究表明，吸煙導致這些疾病的主要機理是氧化應激。當細胞發(fā)生氧化應激時，細胞內活性氧族（ROS）以及活性氮族（RON）增加，對脂質、蛋白質以及DNA 等會產(chǎn)生不同程度的氧化損傷［9-11］，同時激活細胞內抗氧化物質如細胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）、還原態(tài)谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶等［12］。在這些抗氧化物中，GSH 和EC-SOD 分別在細胞內和細胞外發(fā)揮重要的抗氧化作用［13-14］。GSH 是細胞內含量豐富的硫醇式縮氨酸，對維持細胞氧化還原平衡發(fā)揮重要作用，被廣泛作為細胞氧化應激標志物［12,14］；EC-SOD 作為細胞抗氧化反應的第一道防線，主要在細胞外基質中對ROS和RON 進行首次催化分解，進而發(fā)揮重要的抗氧化作用［13,15-16］。在以往研究中，卷煙煙氣的體外毒理學評價研究主要集中在細胞毒性和遺傳毒性等方面［17-20］。有關煙氣氧化損傷的生物效應研究也有部分報道。Tollefson 等［21］發(fā)現(xiàn)EC-SOD 對卷煙煙氣萃取物誘導的肺泡巨噬細胞的氧化應激反應具有明顯保護作用；米娜等［22］在研究卷煙煙氣萃取物對線粒體的氧化損傷時，檢測到卷煙煙氣萃取物染毒后的支氣管上皮細胞內GSH 顯著降低；Kaushik 等［23］發(fā)現(xiàn)卷煙煙氣萃取物通過干擾細胞氧化還原平衡來調節(jié)細胞增殖，該過程與細胞內還原態(tài)谷胱甘肽與氧化態(tài)谷胱甘肽比值（GSH/GSSG）的水平緊密相關。有研究表明，EC-SOD等氧化應激指標的表達在不同暴露時間下會表現(xiàn)出一定程度的差異［1,24］。在本研究中，擬選取GSH和EC-SOD 作為卷煙煙氣誘導細胞發(fā)生氧化應激反應的生物標志物，通過檢測卷煙煙氣總粒相物（TPM）在不同染毒時間下GSH/GSSG 和EC-SOD水平的變化，分別從胞內和胞外水平研究TPM 誘導的細胞氧化損傷，旨在為卷煙煙氣誘導的氧化應激研究提供科學依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

3R4F 參比卷煙（美國肯塔基大學）；人肺腺癌細胞A549（中國上海生科院細胞資源中心）。

RPMI-1640 基礎培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺（純度99.9%）（北京Solarbio 公司）；中性紅染料（純度99.0%，美國Sigma公司）；胎牛血清（生化級，美國Gibco公司）；胰酶（500 U/mg，美國Amresco 公司）；氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、七水合磷酸氫二鈉、無水乙醇、冰醋酸（AR，天津凱通化學試劑有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，生化級，美國Amresco 公司）；GSH/GSSG ELISA 試劑盒（美國ScienCell 公司）；Cu/Zn-SOD ELISA 試劑盒（美國eBioscience 公司）。

HERA Cell 240 CO2細胞培養(yǎng)箱、HFU486 超低溫冰箱（德國Thermo 公司）；Sigma 1-14 微型高速離心機、Sigma 3-18K 低溫高速離心機（德國Sigma 公司）；SW-CJ-2FD 超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；SPECTRA MAX 190 酶標儀（日本Bio-Rad 公司）；6 孔板、96 孔板（美國Corning Costar 公司）；TH 4-200 熒光倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；1 和5 mL 微量移液器（德國Eppendorf 公司）；RM20H 轉盤型吸煙機（德國Borgwaldt KC 公司）；Milli-Q 超純水純化系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；TS-2 脫色搖床（北京中儀所）；DQHZ-2001A 大容量全溫度搖床（江蘇太倉華美生化儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 TPM 制備

將3R4F 參比卷煙于（22±1）℃，相對濕度（60±3）%條件下平衡48 h；按照標準（ISO 4387:2000）抽吸模式，在RM20H 轉盤型吸煙機上抽吸20 支卷煙，用92 mm 的劍橋濾片捕集TPM；將劍橋濾片置于50 mL 錐形瓶中，根據(jù)捕集的TPM 質量，加入適量DMSO，使TPM 終濃度為10 mg/mL（母液），然后放置在搖床上于室溫下振蕩萃取20 min，過濾，分裝凍存，備用。

1.2.2 細胞培養(yǎng)

將A549 細胞于含10%（體積分數(shù)）胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞生長匯合度達到80%后，用0.25%（體積分數(shù)）胰酶消化，離心，棄去上清液；加入新鮮的培養(yǎng)基制成細胞懸液，以1.5×104個/孔的細胞密度接種于96 孔板，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內孵育24 h；移去培養(yǎng)基，實驗組分別加入10、25、50、75、100、120、140、160 和200 μg/mL TPM 溶液，陰性對照組加入20 μL/mL DMSO溶液，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內孵育24 h，之后進行中性紅細胞毒性試驗。

將A549 細胞以4.5×105個/孔的細胞密度接種于6 孔板，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內孵育24 h；移去培養(yǎng)基，實驗組分別加入75 和100 μg/mL TPM 溶 液，陰性對照組加入10 μL/mL DMSO 溶液，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內分別孵育4 和24 h，之后進行氧化應激指標GSH/GSSG 和EC-SOD 的檢測。

1.2.3 中性紅細胞毒性試驗

移去96 孔板內培養(yǎng)基，用PBS 洗滌；加入中性紅染液（質量濃度50 μg/mL），于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內孵育3 h；移去孔內染液，用PBS 洗滌；加入中性紅萃取液（50%乙醇，49%去離子水，1%冰醋酸），振蕩萃取20～30 min，于酶標儀540 nm 下檢測吸光度。

1.2.4 氧化應激指標檢測

（1）GSH/GSSG 檢測。6 孔板內的細胞經(jīng)75 μg/mL 或100 μg/mL TPM 染毒4 或24 h 后，收集孔內培養(yǎng)基，離心后，取上清液，分裝并于-80 ℃凍存?zhèn)溆??？變燃毎?.25%胰酶消化，收獲細胞。參照ScienCellTMGSH/GSSG ELISA 試劑盒說明書進行操作，即:細胞經(jīng)細胞裂解液重懸，冰上放置5 min 后，于4 ℃、10 000 g 條件下離心10 min，收集上清液；將上清液分為兩份，并以50 μL/孔加入到96 孔板內，其中一份樣品孔加入1 μL 清除劑靜置1 min，用于檢測GSSG，另一份沒有添加清除劑的樣品孔用于檢測全部的GSH；所有檢測樣均加入150 μL 工作液，靜置2 min，并以50 μL/孔加入輔酶NADPH 稀釋溶液。用酶標儀在412 nm 下檢測吸光度。

（2）EC-SOD 檢測。收集的培養(yǎng)基上清液樣品，參照Cu/Zn-SOD ELISA 試劑盒說明書進行檢測，即:將抗體包被板先用洗滌液清洗2 次，然后每孔加入100 μL 樣品，并以50 μL/孔用量加入現(xiàn)配的辣根過氧化酶同源物稀釋劑，密封后室溫下振蕩1 h；洗滌液清洗3 次，以100 μL/孔用量加入基質溶液，室溫下避光振蕩10 min；立即以100 μL/孔用量加入終止液，并放入酶標儀中檢測450 nm 下的吸光度。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Origin 8.1 和SPSS 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理。數(shù)據(jù)用±SD 表示，P＜0.05 為顯著性差異，P＜0.01 為極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 TPM 與細胞存活率的劑量-效應關系

采用中性紅攝取試驗檢測3R4F 參比卷煙主流煙氣TPM 對A549 細胞的細胞毒性效應，共進行4 次獨立實驗，每次獨立實驗設置6 個重復。結果（圖1）顯示，隨著TPM 濃度的增加，TPM 與A549細胞存活率之間存在良好的劑量-效應關系。

圖1 3R4F 參比卷煙TPM 與細胞存活率的劑量-效應關系

2.2 TPM 誘導的細胞氧化應激

為進一步研究由卷煙煙氣TPM 誘導的細胞氧化應激，選擇細胞存活率70%以上的TPM 劑量進行染毒，即染毒劑量為75 和100 μg/mL，對應的細胞存活率分別為（89.1±13.0）%和（74.7±15.9）%。

2.2.1 TPM 對細胞內GSH 代謝的影響

分別進行了3 次獨立實驗，結果（圖2）顯示，在選定的TPM 染毒劑量（75 和100 μg/mL）下，采用相同的染毒時間，實驗組的GSH/GSSG 明顯低于陰性對照組（P＜0.01）。同時，在相同的染毒劑量下，GSH/GSSG 在染毒4 與24 h 的實驗組之間不存在顯著性差異。表明在TPM 短時間染毒（4 h）和長時間染毒（24 h）下，細胞均發(fā)生了氧化應激，與文獻研究結果相一致［1］。原因可能是細胞內氧化性物質的過量表達增加了GSH 氧化生成GSSG的速率，使GSH 濃度急劇降低，GSSG 不斷積累，最終導致GSH/GSSG 相對陰性對照組有明顯降低［14］。但Colombo 等［25］在研究煙氣對人牙齦纖維母細胞的氧化損傷時，根據(jù)質譜分析結果認為，煙氣暴露后GSH 的明顯減少和GSSG 的微量增加歸因于GSH 的烷基化。此外，也有文獻報道，GSH/GSSG的降低也可能與GSH 合成過程中的限速酶（γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶）被氧化并導致GSH 合成受限制有關［26-27］。

圖2 TPM 誘導的A549 細胞GSH/GSSG 變化

2.2.2 TPM 對EC-SOD 表達的影響

EC-SOD 是超氧化物歧化酶（SOD）在細胞外的主要存在形式，也是細胞首要的自由基清除劑。通過3 次獨立實驗對TPM 染毒A549 細胞后的EC-SOD 進行了測定，結果（圖3）顯示，在用TPM 短時間染毒（4 h）條件下，實驗組EC-SOD相對于陰性對照組沒有明顯增加。但隨著染毒時間的延長（24 h），實驗組EC-SOD 極顯著地高于陰性對照組（P＜0.01），并且低劑量組（75 μg/mL）與高劑量組（100 μg/mL）也呈現(xiàn)極顯著性差異（P＜0.01）；此外，用相同劑量的TPM 染毒時，24 h 染毒組的EC-SOD 水平也極顯著地高于4 h染毒組（P＜0.01）。原因可能是卷煙煙氣誘導細胞SOD 表達之前，細胞本身需要產(chǎn)生大量的活性氧以及超氧陰離子，而該過程需要一定的反應時間才能實現(xiàn)，因此進行較短時間的染毒并不能明顯地觀察到EC-SOD 表達量的增加［24］。據(jù)文獻報道，卷煙煙氣首先使細胞內神經(jīng)酰胺積累，達到一定濃度后會誘導SOD 的表達［12,28］。可見，外源性物質在誘導EC-SOD 表達時需要一定的反應時間。

圖3 TPM 誘導的A549 細 胞EC-SOD 變化

3 結論

①在TPM 分別染毒4 h 和24 h 后，A549 細 胞內GSH/GSSG 相對陰性對照組顯著降低，且在TPM 染毒24 h 后GSH/GSSG 相對于4 h 染毒組無明顯增加，表明在本實驗條件下增加TPM 染毒時間對GSH/GSSG 無顯著性影響。②在TPM 染毒時間從4 h 增加到24 h 時，EC-SOD 顯著增加，并且隨TPM 染毒劑量的增加而增加，表明TPM 染毒時間對細胞外EC-SOD 的表達有一定的影響。

［1］Kode A,Yang S R,Rahman I.Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells［J］.Respiratory Research,2006,7:132.

［2］Bishop E,Theophilus E H,Fearon I M.In vitro and clinical studies examining the expression of osteopontin in cigarette smoke-exposed endothelial cells and cigarette smokers［J］.BMC Cardiovasc Disorders,2012,12（1）:75.

［3］Pryor W A,Stone K.Oxidants in cigarette smoke radicals,hydrogen peroxide,peroxynitrate,and peroxynitrite［J］.Annals of the New York Academy of Sciences,1993,686（1）:12-27.

［4］Putnam K P,Bombick D W,Doolittle D J.Evaluation of eight in vitro assays for assessing the cytotoxicity of cigarette smoke condensate［J］.Toxicology In Vitro,2002,16（5）:599-607.

［5］Lannan S,Donaldson K,Brown D,et al.Effect of cigarette smoke and its condensates on alveolar epithelial cell injury in vitro A549［J］.The American Journal of Physiology,1994,266（1）:L92-L100.

［6］Rovina N,Koutsoukou A,Koulouris N G.Inflammation and immune response in COPD:Where do we stand?［J］.Mediators of Inflammation,2013,413735:1-9.

［7］Arja C,Surapaneni K M,Raya P,et al.Oxidative stress and antioxidant enzyme activity in South Indian male smokers with chronic obstructive pulmonary disease［J］.Respirology,2013,18（7）:1069-1075.

［8］Howard G,Wagenknecht L E,Burke G L,et al.Cigarette smoking and progression of atherosclerosis:The atherosclerosis risk in communities（ARIC）study［J］.Journal of the American Medical Association,1998,279（2）:119-124.

［9］Faux S P,Tai T,Thorne D,et al.The role of oxidative stress in the biological responses of lung epithelial cells to cigarette smoke［J］.Biomarkers,2009,14（S1）:90-96.

［10］Rahman I,Van Schadewijk A A,Crowther A J,et al.4-Hydroxy-2-nonenal,a specific lipid peroxidation product,is elevated in lungs of patients with chronic obstructive pulmonary disease［J］.American Journal Respiratory and Critical Care Medicine,2002,166（4）:490-495.

［11］Leanderson P,Tagesson C.Cigarette smoke-induced DNA-damage:Role of hydroquinone and catechol in the formation of the oxidative DNA-adduct,8-hydroxydeoxyguanosine［J］.Chemico-Biological Interactions,1990,75（1）:71-81.

［12］Cantin A M.Cellular response to cigarette smoke and oxidants:Adapting to survive［J］.Proceedings of the American Thoracic Society,2010,7（6）:368-375.

［13］Regan E A,Mazur W,Meoni E,et al.Smoking and COPD increase sputum levels of extracellular superoxide dismutase［J］.Free Radical Biology and Medicine,2011,51（3）:726-732.

［14］Rahman I,Macnee W.Lung glutathione and oxidative stress:Implications in cigarette smoke-induced airway disease［J］.The American Journal of Physiology,1999,277（6）:L1067-L1088.

［15］Bowler R P,Crapo J D.Oxidative stress in allergic respiratory diseases［J］.Journal of Allergy and Clinical Immunology,2002,110（3）:349-356.

［16］Bowler R P,Hokanson J,Taylor M,et al.Extracellular superoxide dismutase（EC-SOD）as a protective factor for risk of chronic obstructive pulmonary disease［J］.European Respiratory Review,2006,15（101）:200-201.

［17］CHEN Huan,CUI Lin,JIANG Xingyi,et al.Evaluation of the cytotoxicity of cigarette smoke condensate by a cellular impedance biosensor［J］.Food and Chemical Toxicology,2012,50（3/4）:612-618.

［18］LIN Chunyan,CHEN Li,HUANG Zhihong,et al.Effect of cigarette smoke extraction on the expression of found in inflammatory zone 1 in rat lung epithelial L2 cells［J］.Chinese Medical Journal,2014,127（12）:2363-2367.

［19］黃波，龍穎，李東陽.卷煙煙氣抽提物對細胞遺傳毒性及茶多酚干預作用［J］.中國公共衛(wèi)生，2013，29（6）:823-825.

［20］盧斌斌，Meng R，Wisse L，等.3 種不同焦油卷煙煙氣的細胞毒性比較［J］.煙草科技,2007（12）:38-41.

［21］Tollefson A K,Oberley-Deegan R E,Butterfield K T,et al.Endogenous enzymes（NOX and ECSOD）regulate smoke-induced oxidative stress［J］.Free Radical Biology and Medicine,2010,49（12）:1937-1946.

［22］米娜，楊陟華，潘秀頡，等.卷煙煙氣對細胞線粒體氧化損傷的研究［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2008，30（3）:257-259.

［23］Kaushik G,Kaushik T,Khanduja S,et al.Cigarette smoke condensate promotes cell proliferation through disturbance in cellular redox homeostasis of transformed lung epithelial type-II cells［J］.Cancer Letters,2008,270（1）:120-131.

［24］An K W,Shin H S,Choi C Y.Physiological responses and expression of metallothionein（MT）and superoxide dismutase（SOD）mRNAs in olive flounder,Paralichthys olivaceus exposed to benzo［a］pyrene［J］.Comparative Biochemistry and Physiology.Part B,2008,149（3）:534-539.

［25］Colombo G,Dalle-Donne I,Orioli M,et al.Oxidative damage in human gingival fibroblasts exposed to cigarette smoke［J］.Free Radical Biology and Medicine,2012,52（9）:1584-1596.

［26］ZOU Xuan,FENG Zhihui,LI Yuan,et al.Stimulation of GSH synthesis to prevent oxidative stress-induced apoptosis by hydroxytyrosol in human retinal pigment epithelial cells:Activation of Nrf2 and JNK-p62/SQSTM1 pathways［J］.Journal of Nutritional Biochemisty,2012,23（8）:994-1006.

［27］Rahman I,Smith C A D,Lawson M F,et al.Induction of γ-glutamylcysteine synthetase by cigarette smoke is associated with AP-1 in human alveolar epithelial cells［J］.FEBS Letters,1996,396（1）:21-25.

［28］Natarajan V,Zhen L,Medler T R,et al.Ceramide upregulation causes pulmonary cell apoptosis and emphysema-like disease in mice［J］.Nature Medicine,2005,11（5）:491-498.