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氟乙酰胺藥物檢測方法的研究

陳濤1，高慶剛2

(1.延安市公安局，陜西延安716000；2.榆林市公安局，陜西榆林719000)

氟乙酰胺殺鼠藥又名敵蚜胺、毒頭王、滅三輩，其毒性大、二次中毒嚴重，為國家禁用的劇毒藥物，現(xiàn)時一些地方仍在非法使用，給人民生命財產(chǎn)造成很大危害，對氧乙酢酰胺藥物的檢測就顯得尤為重要。

1氟乙酰胺的基本特性

1.1物理特性

白色針狀結(jié)晶，無味，微堿性，易溶于水、甲醇、乙醇等，微溶于二氯甲烷、氯仿，難溶于石油醚。

1.2代謝機理

此類藥物進入生物體內(nèi)迅速代謝為氟乙酸，此物質(zhì)為小分子，且極性大，易溶于水，與三磷酸腺苷和輔酶A作用而形成氟乙酸輔酶A，然后與檸檬酸作用形成氟檸檬酸，從而抑制烏頭酸酶，使三羧酸循環(huán)受阻，進而損害神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致一系列的病變。其性質(zhì)穩(wěn)定，毒性強，致死量(人)約為50～100 mg。

1.3檢材提取

由于氟乙酰胺在體內(nèi)易轉(zhuǎn)化為氟乙酸，檢材物以嘔吐物、剩余食物、胃內(nèi)容物為最佳，其次選擇血、肝、腎、尿。在死亡較快且檢驗及時的情況下，可從胃內(nèi)容物、胃組織、血、腎組織檢出氟乙酰胺，而其它檢材如心、腸組織、尿則不易檢出，但可檢出其代謝產(chǎn)物氟乙酸。氟乙酰胺一般用水浸泡提取，或配比一定比例的強極性有機溶劑提取，常見有乙腈/水、丙酮/水、甲醇/水。有時也用弱極性有機溶劑(如乙酸乙酯)提取，此法可以減少雜質(zhì)干擾，從中加入食鹽至飽和可提高萃取效率。

2檢驗方法

2.1化學(xué)法

硫靛反應(yīng)法是分析氟乙酰胺藥物最為普遍的化學(xué)方法[1]，此方法反應(yīng)條件較易掌握，且操作簡單，其原理主要是根據(jù)對最終反應(yīng)產(chǎn)物硫靛的顏色變化來進行定性。用甲醇：水(7：3)做提取劑浸泡血、尿等生物檢材，離心10 min，取上清液，加入硫代水楊酸后用NaOH溶液調(diào)堿性，加熱，放置冷卻，再加鐵氰化鉀，加氯仿，溶液若顯洋紅色為陽性，否則，為陰性。實驗表明，此反應(yīng)在適當(dāng)條件下靈敏度高，干擾少，也是檢驗氟乙酰胺比較理想的化學(xué)反應(yīng)。缺點是有時出現(xiàn)假陽性，可采用氣質(zhì)聯(lián)用儀和紫外可見分光光度計檢測，實驗結(jié)果靈敏度達到20μg，此法從而解決了硫靛法檢驗氟乙酰胺準確性不強的問題?？偟膩碚f，從基層至地方毒檢單位，此法仍是檢驗氟乙酰胺較為理想的方法之一。

2.2色譜法

2.2.1薄層色譜法用TLC(薄層色譜)法對氟乙酰胺進行檢測，得到最小檢出限0.1μg的好效果。將硫靛反應(yīng)的氯仿層濃縮，然后在硅膠G板上進行層析，由于其產(chǎn)物本身為洋紅色，所以不需顯色劑，用乙酸乙酯：丙酮=4∶1或氯仿：乙醇=5∶1作展開劑，得到檢出限為1～2μg。采用萘氏試劑作為顯色劑，氟乙酰胺顯黃至紅褐色，采用乙酸乙酯：丙酮=60∶40作展開劑，得到最低檢出限為10μg，這些實驗結(jié)果顯示薄層色譜靈敏度不高。[2]

2.2.2氣相色譜法氣相色譜法(GC)是目前使用較多的方法。GC/NPD原理是氟乙酰胺在酸性條件下以N，N’-二環(huán)乙基-碳酰亞胺(DDC)作催化劑與芳香胺進行衍生化反應(yīng)，再用乙酸乙酯作萃取劑進行提取，然后使用GC/NPD檢測。此方法的最低檢測限為0.2μg/ml；關(guān)于GC/FID，用此法對于新鮮臟器可不需衍生化直接進行檢測，且空白臟器無干擾。此方法的最低檢測限為0.5μg/ml。但是FID檢測器屬通用型，一般CH的物質(zhì)均可檢出，因此檢測專屬性不強；關(guān)于GC/ECD，用五氟卞基溴(PFBBr)作衍生化試劑對氟乙酸進行衍生化，生成乙酸五氟卞基酯(FAC-PFB酯)，然后用GC/ECD進行分析[3-4]。此方法用PFBBr衍生化，血液中最小檢測限可達2.0 ng/ml，靈敏度最高。但在生物臟器中還含有一定量的各種有機酸物質(zhì)，能與PFBBr反應(yīng)形成衍生物，因此會出現(xiàn)大量雜質(zhì)峰，從而影響到檢測器和色譜柱。

2.2.3氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC/MS)對嘔吐物、胃內(nèi)容、血、肝或吃剩食物等檢材，通過水解，使氟乙酰胺轉(zhuǎn)化成氟乙酸后，以乙酸乙酯為提取劑，用PFBBr作為衍生化試劑對氟乙酸進行衍生化，使氟乙酸衍生為乙酸五氟卞基酯(FAC-PFB酯)[5]，然后通過GC/MS分析。實驗結(jié)果顯示，測得的FAC-PFB酯分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，分子量為258。此質(zhì)譜圖上有4個主要特征碎片離子：m/z177，178，181，258。其中基峰為m/z181，而m/z181，178處無雜質(zhì)峰干擾，這樣使得定性比較容易，可靠性大大提高。

2.2.4液相色譜法氟乙酰胺的液相色譜法可分為液相色譜熒光(HPLC/FLD)和液相色譜紫外(HPLC/UVD)法。因氟乙酰胺本身對紫外是沒有吸收的，所以先要通過衍生化使其轉(zhuǎn)變成含有紫外基團的衍生物才能進行檢測。4-溴甲基-7-甲氧基香豆素(BrMMC)是HPLC理想衍生化試劑，其具有熒光活性。首先用乙腈對檢材血樣沉淀蛋白，再依次加入衍生化試劑BrMMC和催化劑四丁基溴化銨，在水浴(75℃)中進行衍生化反應(yīng)，衍生物用HPLC/UVD和HPLC/FLD分別進行檢測。測得最低檢出限：紫外為0.10 μg/ml；熒光為0.05 μg/ml。最佳色譜條件：乙腈：水=40∶60；FID檢測激發(fā)波長為319 nm，發(fā)射波長為390 nm，UVD檢測波長為319 nm。熒光檢測法和紫外檢測法分別在0.16-15.30 μg/m和l0.30-38.40 μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系?？傻贸鯤PLC/UVD和HPLC/FLD法具有很好的準確性、靈敏度和精密度[6-7]。因熒光檢測器在高靈敏度和高選擇性上都優(yōu)于紫外檢測器，所以選擇液相色譜熒光檢測器能使分析效果達到更好。

2.2.5液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(LC/MS)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(LC/MS)常用的離子化方式是電噴霧離子化(ESI)檢測模式，對檢材血在該模式下實驗，檢測得到定性和定量離子峰為m/z77，最低檢測限為2.0 ng/ml。選擇對檢材血采用大氣壓化學(xué)電離(APCI)方式，SRM正離子模式方式檢測，氟乙酰胺母離子78，子離子61。此法測得氟乙酰胺最低檢測限為10 μg/ml，且在10～500 μg/ml具有良好的響應(yīng)。因ESI效率較APCI低，且氟乙酸類藥物熱穩(wěn)定性較好，所以通常采用APCI。若選擇ESI，需結(jié)合已經(jīng)使用的衍生化方式先進行柱前衍生化，而后再進行液質(zhì)檢測，則可以提高ESI效率[8]。

3小結(jié)

綜上所述，對氟乙酰胺藥物的檢測中GC/ECD法是靈敏度最高且使用最廣泛的方法之一。但是由于生物檢材中含有較多的內(nèi)源性雜質(zhì)，從而對單一用氣相檢測的準確性產(chǎn)生一定影響。而薄層色譜法靈敏度差是其缺點。硫靛反應(yīng)法雖方法簡便易掌握，但易出現(xiàn)假陽性，結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀和紫外分光光度計則使方法復(fù)雜化了。利用GC/MS或LC/MS聯(lián)用檢測生物體內(nèi)微量的氟乙酸類物質(zhì)可以解決有假陽性出現(xiàn)的問題，且此法具有很高的靈敏度和精密度，對檢驗結(jié)果起到確證，使得定性、定量更加容易?？傊?，有關(guān)氟乙酰胺的測定，需要根據(jù)相關(guān)檢材以及本部門儀器設(shè)備等實際情況，制定出若干種便于操作及準確性好的方來操作，要盡可能地減少失誤，為決策層提供可靠和正確的依據(jù)。隨著現(xiàn)代化技術(shù)的不斷進步，今后將會有更加簡便易行的檢測方法得以推廣和應(yīng)用，而GC/MS或LC/MS法將成為今后檢測氟乙酰胺藥物較為理想的方法。

參考文獻

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[收稿日期2015-06-12；責(zé)任編輯徐文梅]

作者簡介：陳濤(1987—)，男，陜西府谷人，雙學(xué)士學(xué)位，助理工程師。