劉 亮 金梅林

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070

細菌毒素的危害及防控

劉 亮 金梅林*

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070

近年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模的不斷擴大，各種傳染病也隨之不斷暴發(fā)，給養(yǎng)殖業(yè)以及人的生命和財產(chǎn)造成巨大損失，而細菌病在其中發(fā)揮著重要的作用，得到了人們的廣泛關(guān)注，細菌毒素作為細菌的一種重要的毒力相關(guān)因子，對其致病性起到至關(guān)重要的作用，尤其關(guān)系到飼料的安全衛(wèi)生，因此必須要對毒素有更深刻的認(rèn)識，從而加以防控，本文從外毒素和內(nèi)毒素2個方面重點介紹了一些獸醫(yī)臨床中危害較為嚴(yán)重的細菌毒素的致病機制和防控措施。

外毒素；內(nèi)毒素；脂多糖；細菌

目前，規(guī)?；B(yǎng)殖場細菌病常年不斷發(fā)生，特別是豬群中發(fā)生各種病毒病時，往往都出現(xiàn)細菌病的混合感染或繼發(fā)感染，導(dǎo)致豬群發(fā)病率與死亡率增高，造成重大的經(jīng)濟損失。而“細菌毒素是某些動物疾病的主要致病因子”卻不能被更多的基層獸醫(yī)和養(yǎng)殖戶所熟悉，因此也未能對此采取有效的防范措施[1]。另外據(jù)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病實驗室2013年報道，從9 028份病料及18 215份血液樣品中，分離鑒定細菌10 817株，其中豬鏈球菌占39.51%、副豬嗜血桿菌占28.55%、腸外大腸桿菌占11.21%、巴氏桿菌占6.03%。除外還檢出傳染性胸膜肺炎放線桿菌、沙門氏菌、丹毒桿菌、支原體及附紅細胞體等病原[2]。由此可見細菌性疾病不僅沒有得到很好地控制，反而不斷地流行。而細菌毒素作為細菌的一種重要的致病因素，與抗生素濫用共同導(dǎo)致了細菌性疾病對養(yǎng)殖業(yè)的嚴(yán)重危害。

細菌毒素分為外毒素和內(nèi)毒素。外毒素是病原菌在代謝過程中分泌到菌體外的蛋白質(zhì)，產(chǎn)生外毒素的細菌主要是一些革蘭氏陽性細菌，例如金黃色葡萄球菌、鏈球菌、破傷風(fēng)桿菌等。少數(shù)革蘭氏陰性菌如多殺性巴氏桿菌和產(chǎn)毒性大腸桿菌等也能產(chǎn)生外毒素。其毒性極不穩(wěn)定，對熱和某些化學(xué)物質(zhì)敏感，容易受到破壞。一般用3%～4%的甲醛溶液處理，其毒性完全消失。外毒素的抗原性較強，能刺激機體產(chǎn)生抗毒素。細菌產(chǎn)生的外毒素對組織的毒性作用有高度的選擇性，各自引起特殊的臨床癥狀。

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁的組成成分、細菌在生活時不能釋放出來，當(dāng)細胞死亡而溶解或用人工方法破壞菌體時才釋放出來，因而稱為內(nèi)毒素。內(nèi)毒素化學(xué)成分比較復(fù)雜，它是磷酸、多糖、蛋白質(zhì)的復(fù)合物。主要成分為脂多糖。其性質(zhì)較穩(wěn)定、耐熱、毒性比外毒素低、其作用沒有組織器官選擇性，不同病原菌所產(chǎn)生的內(nèi)毒素引起的癥狀大致相同，都能引起機體體溫升高、腹瀉和出現(xiàn)出血性休克和其他組織損傷現(xiàn)象。

盡管細菌的外毒素和內(nèi)毒素在結(jié)構(gòu)性質(zhì)和作用機制上完全不同，但都能不同程度地對機體產(chǎn)生嚴(yán)重損害。為了感染宿主，細菌必須產(chǎn)生一種機制來對抗宿主的免疫系統(tǒng)，從而使自己能夠在宿主體內(nèi)惡劣的環(huán)境下存活，于是在這個感染過程中不同的毒力因子在不同的時段被表達，而這些毒力因子中最重要的一種就是毒素[3]。細菌毒素根據(jù)它們的感染模式可以分為3種：一型毒素能夠破壞宿主細胞但不進入宿主細胞，這些毒素包括一些金黃色葡萄球菌和化膿鏈球菌產(chǎn)生的超抗原[4]；二型毒素能夠破壞宿主細胞膜侵入宿主細胞內(nèi)部對宿主造成危害，例如溶血素和磷脂酶等[5]；三型毒素有特殊的二元結(jié)構(gòu)也就是通常所說的AB雙元系統(tǒng)，B結(jié)構(gòu)結(jié)合于宿主細胞表面，此時A結(jié)構(gòu)產(chǎn)生酶活性損傷宿主細胞，這類毒素包括志賀毒素、炭疽致死毒素、霍亂毒素等。宿主的免疫系統(tǒng)能夠識別細菌的毒素，通過宿主表面的一些獨特的模式識別受體（PRRs），這些PRRs可以特異性地結(jié)合病原菌表面的一些保守結(jié)構(gòu)[6]，從而造成病原菌對宿主細胞的危害。很多細菌可以產(chǎn)生多種毒素，但一些毒素的作用機理尚不清楚，尤其是一些外毒素，在這里介紹獸醫(yī)臨床中危害較大的一些細菌毒素。

1 外毒素

1.1 豬鏈球菌毒素

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是一種重要的細菌性豬病病原，給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。當(dāng)感染后，病豬通常會出現(xiàn)腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎以及敗血癥等癥狀，該菌按照血清型的不同，可分為33個血清型（1～31型、33型和1/2型），其中豬鏈球菌血清型2型（SS2）在世界范圍內(nèi)被廣泛報道為最主要的致病性血清型。另外，SS2也是一種重要的人畜共患病病原。1998年和2005年在我國發(fā)生的兩次大規(guī)模人感染事件給人們的生命和財產(chǎn)造成了巨大的損失，而且在感染人群中發(fā)現(xiàn)中毒性休克綜合癥[8]，豬鏈球菌的毒素主要以外毒素為主，目前豬鏈球菌被報道能夠分泌大量的分泌蛋白[9]，但只有溶血素（Sly）的研究較為廣泛，Sly是一個54ku的細胞外分泌蛋白，是一種依賴于膽固醇的細胞穿孔毒素[10]，其家族還包括肺炎球菌毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素、李斯特菌毒素、溶血性鏈球菌毒素，分別對于肺炎鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、李斯特菌、化膿鏈球菌的致病起到重要作用[11]，豬鏈球菌溶血素對于各種宿主上皮細胞[12]、微管上皮細胞[13]、中性粒細胞[14]和單核/巨噬細胞[15]都具有顯著的細胞毒性作用，除了細胞毒性以外，有人還發(fā)現(xiàn)Sly的表達可以在不影響豬鏈球菌與豬中性粒細胞黏附的情況下，有效地減少宿主細胞的內(nèi)吞作用[16]，不僅如此，Sly還能夠激活吞噬細胞從而誘導(dǎo)大量的炎性細胞因子[17]，有報道稱Sly陽性的豬鏈球菌釋放的大量Sly能夠損壞血腦屏障，但Sly并不是豬鏈球菌突破血腦屏障所必不可少的，因為一些Sly陰性的豬鏈球菌也能夠突破血腦屏障[18]。在泰國豬鏈球菌流行的序列型主要是序列型1（ST1）和序列型104（ST104），前者除了引起敗血癥外還引起腦膜炎，而后者只能引起敗血癥，研究表明能引起腦膜炎的ST1豬鏈球菌的溶血素表達量明顯高于不引起腦膜炎的ST104，由此可見溶血素對于豬鏈球菌引起腦膜炎具有重要作用。

1.2 副豬嗜血桿菌毒素

副豬嗜血桿菌（Haemophiluspara suis，HPS）是豬上呼吸道的一種常在菌或條件致病菌，1910年K. Glasser首先發(fā)現(xiàn)并報道該病原，該菌感染豬后可引發(fā)多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎。近年來，由副豬嗜血桿菌所引起的革拉瑟氏病已成為影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的一種重要細菌性疾病[19]。副豬嗜血桿菌目前被公認(rèn)的毒素為細胞致死膨脹毒素（CDT）。細胞致死膨脹毒素是一個三聚體復(fù)合物，是由CdtA、CdtB、CdtC 3個亞基組成，屬于細菌蛋白毒素家族，它的主要功能是能夠阻止細胞分裂周期，導(dǎo)致細胞周期的停滯和細胞的死亡[20]，CdtB與 Dnase I家族氨基酸序列具有一定相似性，表達純化的CdtB可以檢測到很低的Dnase活性。當(dāng)CdtA、CdtC同時進入到宿主細胞時，CdtB就被激活，然后轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)，引起DNA的損傷[21]。據(jù)相關(guān)報道表明副豬嗜血桿菌中存在兩個有功能的CDT，并研究了其功能，結(jié)果表明CDT三聚體對于細胞展現(xiàn)出最大的毒性（相對于單體），而且即使是二聚體也比單體的毒性要高，通過構(gòu)建缺失突變株比較毒力發(fā)現(xiàn)，缺失CDT后對于豬血和兔血殺菌作用的抵抗能力顯著下降，同時對豬臍靜脈上皮細胞和豬腎上皮細胞的黏附和侵襲力明顯下降[22]。由此可以看出CDT在副豬嗜血桿菌的致病過程中發(fā)揮著重要的作用，是其重要的毒力因子。

1.3 傳染性胸膜肺炎放線桿菌毒素

豬傳染性胸膜肺炎病又稱壞死性胸膜肺炎，是由胸膜肺炎放線桿菌（APP）引起的高度接觸性傳染性呼吸道疾病。本病在1957年被首次報道后，頻頻在世界各地暴發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟損失。APP感染能造成豬肺部損傷，引起壞死性肺炎和纖維素性胸膜炎，同時也為其它病原的趁虛而入創(chuàng)造了條件。同時由于血清型眾多（15個血清型），而且各地流行的優(yōu)勢血清型不同，也為該病的防控造成了一定的困難。APP在致病過程中可以產(chǎn)生一種重要的外毒素（Apx），其具有細胞特異和種特異的溶血性、白細胞毒性、白細胞刺激性等特性，并且在抵御宿主巨噬細胞的吞噬及嗜中性粒細胞的殺細胞毒性方面都有重要作用。

目前在APP中已發(fā)現(xiàn)4種不同的Apx毒素，即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ[23]，所有的具有毒力的APP至少能夠表達1～2種以上毒素，研究表明ApxⅣ對于APP的毒力是非常重要的[24]，它只在體內(nèi)條件下表達[24-25]，然而ApxⅣ在病原致病過程中的具體作用尚不明確，ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ對于中性粒細胞和巨噬細胞具有很大的損傷作用，因此在抵抗宿主的免疫反應(yīng)中也起到很大作用，ApxⅠ可以誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細胞凋亡[26]，ApxⅢ對哺乳動物外周血淋巴細胞（PBMcs）有毒性，它具有較強的細胞特異性，在與豬PBMcs作用20 min后便產(chǎn)生毒性，而駱駝、人、狗、大鼠和小鼠的PBMcs對ApxⅢ不敏感。豬上皮細胞對ApxⅢ也不敏感，說明ApxⅢ是細胞特異性毒素[27]。

1.4 多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）毒素

Pm是一類能引起畜、禽、寵物、野生動物及人類感染、并嚴(yán)重發(fā)病的重要人畜共患性病原菌，該病在世界范圍內(nèi)廣泛流傳，無宿主特異性甚至可以在不同的宿主間發(fā)生種間傳播，可以引起禽霍亂、豬肺疫、豬萎縮性鼻炎、牛出血性敗血癥等以敗血癥、肺炎、鼻炎為主要特征的疾病。其中能夠引起豬進行性萎縮性鼻炎（PAR）的產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌分泌一種約146ku的皮膚壞死毒素（Pasteurella multocidatoxin，PMT），可直接引起豬鼻炎、鼻梁變形、鼻甲骨萎縮甚至消失，全身代謝障礙，生產(chǎn)性能下降，同時可誘發(fā)其它病原微生物感染，甚至導(dǎo)致死亡。目前，PAR被譽為世界規(guī)?；B(yǎng)豬五大傳染病之一，并被國際獸疫局（OIE）定為須上報疫情的動物傳染病。該毒素是一種促有絲分裂原，它可與哺乳動物細胞上的受體結(jié)合，進入細胞后，可以獨自啟動DNA的合成，導(dǎo)致細胞生長和分裂[28]，激活成骨細胞有絲分裂致使骨細胞的異常生長以及形態(tài)變化，最終導(dǎo)致破骨細胞對骨細胞的裂解。該毒素屬于明顯的AB系統(tǒng)侵入模式，目前證明其黏附作用位點位于N段，催化作用位點位于C段，中間為跨膜區(qū)。

2 內(nèi)毒素

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜上的脂多糖成分，是革蘭氏陰性菌的主要抗原性及致病性成分（lipopolysaccharide，LPS），其結(jié)構(gòu)中內(nèi)脂A和2-酮基-3-脫氧辛酸（KDo）是內(nèi)毒素的毒性部分所在，通常LPS以完整的形式存在于細菌細胞外膜上，當(dāng)其從菌體上游離下來，成為可溶性的游離LPS時具有廣泛的生物活性，其活性是細胞壁上內(nèi)毒素的50～100倍。內(nèi)脂A結(jié)構(gòu)的完整性與LPS的毒性相關(guān)，如引起機體發(fā)熱、局部反應(yīng)或致死性休克[1]。內(nèi)脂A和KDo是LPS中最具有毒性的部分，但也具有激活機體免疫系統(tǒng)、引起機體產(chǎn)生抗體的作用。不同的細菌常常產(chǎn)生不同的細菌內(nèi)毒素并導(dǎo)致機體不同類型和不同程度的病理損傷，如：腸凝聚性大腸桿菌毒素導(dǎo)致腸炎；大腸桿菌細胞致死腫脹毒素導(dǎo)致仔豬水腫病；產(chǎn)毒素大腸桿菌耐熱性腸毒素Ⅱ?qū)е伦胸i黃白痢；志賀樣毒素導(dǎo)致出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合癥；葡萄球菌腸毒素B導(dǎo)致腸炎；支原體毒素導(dǎo)致敗血性肺炎；魏氏梭菌腸毒素導(dǎo)致腹瀉；李氏桿菌溶血素導(dǎo)致腦膜腦炎等[29]。很多嚴(yán)重疾病都直接或間接與革蘭陰性菌感染及其釋放的內(nèi)毒素有關(guān)。同時LPS能夠誘導(dǎo)大量的細胞因子、黏附分子以及NO等引起機體細胞的損傷和屏障功能的改變，導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致高血壓、中毒性休克、多器官功能衰竭甚至死亡。有報道稱一些細菌的LPS能夠促進外毒素對于宿主細胞的毒性作用。

另一方面內(nèi)毒素作為革蘭氏陰性菌的一種致病因素，同外毒素不同，其結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，大部分較為穩(wěn)定，一般抗生素和高溫等條件很難將其徹底消滅，當(dāng)利用消毒劑殺滅致病菌后，細菌細胞壁上的內(nèi)毒素依然殘存于畜禽舍內(nèi)或空氣中，這些內(nèi)毒素同樣可損害免疫系統(tǒng)并威脅畜禽的健康，但其危害作用還不被人們所認(rèn)識[30]，大量研究表明抗生素不但不能抑制內(nèi)毒素的生物學(xué)活性，而且在治療革蘭陰性菌感染時會誘導(dǎo)大量內(nèi)毒素釋放[31]，使該類疾病治療的難度增加。

3 毒素的防控

3.1 外毒素的防控

目前對于產(chǎn)外毒素細菌的控制主要使用相應(yīng)的抗生素以及細菌疫苗，由于外毒素的毒性雖強但不夠穩(wěn)定，所以防控細菌本身對于防控其產(chǎn)生的外毒素尤為重要，加強畜舍衛(wèi)生管理，及時消毒殺菌，保證水源干凈衛(wèi)生，保持飼料新鮮，含水量不能太高，對于例如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等腸道細菌同時降低蛋白含量避免畜禽采食后不能迅速消化而在腸道內(nèi)大量繁殖[1]。同時針對不同的細菌采用其敏感的抗生素，抑制細菌生長從而控制其毒素的產(chǎn)生。另外利用細菌外毒素研制出來的細菌類毒素疫苗和單克隆抗體，目前已經(jīng)得到開發(fā)應(yīng)用。

3.2 內(nèi)毒素的防控

內(nèi)毒素作為一種普遍存在的細菌毒素與外毒素不同，往往不能通過相應(yīng)的抗生素來徹底消滅，相反某些抗生素能夠刺激細菌內(nèi)毒素的釋放，造成適得其反的效果。目前經(jīng)常在細菌感染早期使用適當(dāng)抗生素，此時不但能夠抑制細菌的生長繁殖還能同時抑制細菌所產(chǎn)生的內(nèi)毒素的積蓄，但在感染中后期，抗生素效果不佳。由于細菌的內(nèi)毒素是脂多糖（LPS），因此往往使用一些特殊物質(zhì)來抑制內(nèi)毒素。

1）溶菌酶抑制內(nèi)毒素作用。溶菌酶是一個由一百多個氨基酸殘基組成的單鏈蛋白質(zhì)，其酶活性機制為能夠破壞細菌細胞壁上的肽聚糖，削弱細菌細胞壁結(jié)構(gòu)，使細胞破裂，廣泛存在于動植物體內(nèi)，不同種類的溶菌酶其結(jié)構(gòu)和酶活性強度不盡相同。[29]有報道稱雞蛋血清溶菌酶和抗生素共同使用，不但可以抑制細菌，還能減少內(nèi)毒素釋放，中和內(nèi)毒素，減輕內(nèi)毒素所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)[32]。

2）殺菌通透性增加蛋白。殺菌通透性增加蛋白（bactericidal permeability-increasing protein，BPI）是一種糖蛋白，主要存在于人和哺乳動物中性粒細胞（PMNL）的嗜天青顆粒中，還有少量存在于嗜酸性細胞的吞噬體或特殊顆粒中。它能夠與細菌內(nèi)毒素結(jié)合從而抑制其活性，利用這種功能合成的BPI模擬肽對內(nèi)毒素感染的小鼠明顯具有治療作用[33]。近年來國外對其研究頗多，并逐漸發(fā)現(xiàn)其還具有很多其他功能，如抗真菌、殺滅寄生蟲等作用，其被學(xué)者稱為未來的“超級抗生素”。[34]

3）陽離子抗微生物多肽。該多肽是白細胞表達的一類多肽，能夠競爭性地抑制LPS與LBP（LPS結(jié)合蛋白）的結(jié)合從而抑制其功能[35]，利用這一特性研制的類似多肽能夠明顯抑制內(nèi)毒素與受體的結(jié)合，從而起到治療和預(yù)防作用。據(jù)報道一些天然抗陽離子多肽及合成類似物都具有阻礙LPS誘生TNF-α、IL-6等細胞炎性介質(zhì)的能力。[29]研究表明陽離子抗微生物多肽能夠明顯抑制LPS對單核細胞的活化，降低其對小鼠的致死毒性[36]。

4）NK細胞溶素。NK細胞溶素是從豬腸道提取的具有抗菌活性的多肽[37]。能夠與LPS結(jié)合從而抑制LPS的作用。

細菌毒素通過不同的致病機理對畜禽業(yè)造成不同程度的損害，防控細菌毒素也成了擺在我們面前的一道亟待解決的難題，雖然目前對于細菌毒素有了一定的認(rèn)識，但是對于其防控措施的完全掌握還需要進一步的研究，相信在不遠的將來我們一定能夠克服這道難題。

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2015-01-10

劉亮，男，1987年生，在讀博士生，研究方向：動物傳染病病原微生物。