應(yīng)景艷，徐愛仁，戎建輝，馬衛(wèi)成，何文躍

(浙江省寧波市泌尿腎病醫(yī)院藥劑科，寧波 315100)

具有近紅外熒光的二氧化鈦納米粒的載藥與體外釋放*

應(yīng)景艷，徐愛仁，戎建輝，馬衛(wèi)成，何文躍

(浙江省寧波市泌尿腎病醫(yī)院藥劑科，寧波 315100)

目的 制備具有近紅外熒光的納米二氧化鈦(TiO2)，并考察納米粒的載藥及體外釋放性能。方法 通過水熱法合成摻雜釤的TiO2(Sm-TiO2)，采用透射電鏡(TEM)對其進(jìn)行表征，測定其熒光光譜，并考察對多柔比星(DOX)的載藥量及體外釋放曲線。結(jié)果 所制備的納米粒分散均勻，外觀呈梭狀，長度100～200 nm，發(fā)射波長640～670 nm，在水中的載藥量達(dá)11.5%，體外釋放具有pH敏感性。結(jié)論 所制備Sm-TiO2有良好的近紅外熒光發(fā)光效果、較高的載藥量及可控的體外釋放，可以作為新型藥物載體深入研究。

二氧化鈦(TiO2)；藥物載體；釋放，pH敏感；近紅外熒光

腫瘤是危害人類生命健康的主要疾病之一，其治療一直是醫(yī)藥研究領(lǐng)域的難題。盡管新型納米給藥系統(tǒng)，如膠束、脂質(zhì)體、納米粒、樹狀大分子等的出現(xiàn)在一定程度上改善治療效果，但仍存在體內(nèi)過程難以實時監(jiān)測等問題。近年來，隨著納米技術(shù)的發(fā)展及活體成像技術(shù)的出現(xiàn)，使載體的體內(nèi)過程監(jiān)控成為可能。活體成像技術(shù)是指利用靈敏的光學(xué)檢測儀器，直接監(jiān)測活體生物體內(nèi)具有熒光的細(xì)胞活動和基因行為的技術(shù)。通過此項技術(shù)，可以直觀的觀測特定基因的表達(dá)、腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程。其對光的波長有一定要求，波長在650～950 nm及1 050～1 300 nm范圍內(nèi)的光具有較好的組織穿透能力，有利于活體成像[1]。二氧化鈦(TiO2)作為一種新型功能納米材料，具有良好的生物相容性，通過稀土離子摻雜后在近紅外區(qū)具有熒光效應(yīng)，可用于活體成像，此外其還具有較高的表面積(300 m2·g-1)[2]，可負(fù)載大量的藥物；同時由于其具有超聲敏化功能，在超聲作用下產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，從而可以殺傷腫瘤細(xì)胞[3-4]。因此筆者擬構(gòu)建稀土離子摻雜的納米二氧化鈦，并以其作為藥物載體，實現(xiàn)藥物定向傳輸。

1 材料與方法

1.1 藥品與試藥 四氯化鈦(TiCl4，批號：20130315)、氨水(批號：T20100118)均為分析純(國藥化學(xué)試劑有限公司)；六水合硝酸釤(SmN3O9·6H2O，阿拉丁試劑有限公司，批號：37198，)；鹽酸多柔比星(DOX，北京華奉聯(lián)博科技有限公司，批號：HF100519，含量>98.0%)；鹽酸多柔比星對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：130509-200301，含量99.5%)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 JEM-1200EX透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)；FP 6500熒光分光光度儀(日本JASCO公司)；TU-1800PC紫外-可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限公司)；TGL-168高速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；SRJX箱式電爐(上海錦屏儀器儀表有限公司)。

1.3 釤摻雜TiO2(Sm-TiO2)的制備 通過TiCl4水解的方法制備納米粒。稱取SmN3O9·6H2O 0.06 g溶于去離子水100 mL中，待完全溶解后，快速攪拌下加入TiCl42 mL，繼續(xù)攪拌10 min，生成納米TiO2前驅(qū)體，攪拌下加入氨水調(diào)節(jié)pH至9.3，繼續(xù)攪拌30 min，離心洗滌數(shù)次后，轉(zhuǎn)移至內(nèi)襯聚四氟乙烯的不銹鋼反應(yīng)釜中進(jìn)行水熱反應(yīng)，220 ℃反應(yīng)3 h后，自然冷卻至室溫，取出后洗滌3次，60 ℃干燥，然后轉(zhuǎn)移至馬弗爐中350 ℃煅燒2 h。所得產(chǎn)物形態(tài)利用透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)進(jìn)行觀察，熒光光譜利用熒光分光光度計在365 nm激發(fā)光下測定。

1.4 DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取DOX對照品，配制2，5，10，20，50，100 μg·mL-1的溶液，分別在488 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由曲線得到濃度與吸光度的函數(shù)方程為C=57.958A-0.230 5，其中C為DOX溶液的濃度(μg·mL-1)，A為488 nm波長條件下所測得的吸光度，擬合優(yōu)度r=0.999 6，說明DOX在2～100 μg·mL-1范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

1.5 DOX的負(fù)載 將一定濃度的 DOX與0.4 mg·mL-1的Sm-TiO2在pH 5.0，6.5，7.4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)及水中攪拌過夜，然后9 600×g離心10 min去除未結(jié)合的DOX，所得物用PBS洗滌數(shù)遍，直到上清液完全無色，所得物(標(biāo)記為DOX -TiO2)重懸后4 ℃ 保存。上清液合并收集，用紫外分光光度儀488 nm波長測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算載藥量。

1.6 DOX -TiO2納米粒的體外釋放研究 精密稱取DOX -TiO2納米粒適量，分別分散于pH 5.0，6.5，7.4介質(zhì)中，配置成1 mg·mL-1溶液，在37 ℃下恒溫振蕩(100 r·min-1)進(jìn)行體外釋放考察，分別在1，2，4，6，8，10，20 h時間點取樣，9 600×g離心10 min，取出上清液，同時補充新鮮釋放介質(zhì)，上清液于488 nm波長測定吸光度計算釋放百分率。

2 結(jié)果

2.1 Sm-TiO2的形貌表征 利用TEM對Sm-TiO2納米粒的形態(tài)進(jìn)行表征，Sm-TiO2外觀呈類梭狀，分散良好，無明顯團聚現(xiàn)象(圖1)，其長度為100～200 nm，寬度為30～50 nm，載藥后，Sm-TiO2納米粒形態(tài)未發(fā)生明顯變化。利用熒光分光光度計測定Sm-TiO2納米粒的熒光光譜(圖2)，結(jié)果顯示納米粒在590～620 nm及640～670 nm均有明顯熒光，所發(fā)出的熒光具有良好的強度，肉眼可見(圖3)，且載藥對其熒光強度無明顯影響。

Fig.1 Transmission electron microscopy(TEM)image of Sm-TiO2

2.2 DOX的負(fù)載 結(jié)果見圖4。隨著pH的增加，在相同DOX濃度條件下，TiO2的載藥量顯著增加。同時DOX在水中仍具有良好的負(fù)載性能，載藥量達(dá)到11.5%。由于DOX在水中較易溶解，因此以水作為負(fù)載介質(zhì)。DOX濃度對載藥量的影響結(jié)果見圖5。隨著藥物濃度的增加，載藥量呈非線性增加，當(dāng)DOX濃度超過100 μmol·L-1時，載藥量增加緩慢，因此可以選擇100 μmol·L-1作為負(fù)載濃度。載藥后，由于DOX的吸附，TiO2納米粒由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色(圖6)，高速離心(10 000 r·min-1，10 min)后，DOX-TiO2聚集到離心管底部，上清液呈無色透明，說明DOX完全吸附到納米粒表面。

圖3 Sm-TiO2在白光及紫外激發(fā)下的熒光照片

Fig.3 Fluorescence photograph of Sm-TiO2under white light and UV

2.3 DOX的釋放 DOX-TiO2在不同pH條件下隨時間變化的體外釋放結(jié)果見圖7。從圖7可以看出，藥物釋放的快慢與介質(zhì)的pH有關(guān)，隨著pH的降低，藥物釋放加快，在pH5.0介質(zhì)中，20 h累積釋放接近70%，這主要與DOX在酸性條件下溶解度較好有關(guān)。

3 討論

本研究運用水熱法合成稀土摻雜的Sm-TiO2，得到分散良好、長度為100～200 nm的梭狀納米粒，并利用熒光分光光度計對該納米粒的熒光光譜進(jìn)行測定，結(jié)果顯示波長在590～620 nm及640～670 nm均有明顯熒光。波長大于650 nm的光具有良好的組織穿透性，因此Sm摻雜的TiO2納米粒在生物成像方面具有一定的應(yīng)用前景。

Fig.4 Drug loading capacity of DOX in water and PBS with different pH

Fig.5 Effect of different concentration of DOX on its drug loading capacity

圖7 在不同pH緩沖液中DOX從DOX-TiO2的釋放曲線

Fig.7 Release curve of DOX from DOX-TiO2in buffers at different pH values

本實驗中，隨著pH的增加，在相同DOX濃度條件下，TiO2的載藥量顯著增加，這主要是由于DOX在酸性條件下溶解度較高，當(dāng)pH降低時DOX以解離狀態(tài)存在，DOX與TiO2之間的疏水作用力減弱，因此載藥量降低，當(dāng)pH較高時，DOX疏水性增加，其與TiO2之間的疏水作用力隨之增加，因此載藥量增加[5-6]。

體外釋放結(jié)果表明介質(zhì)的pH對DOX-TiO2的體外釋放具有明顯影響，pH越低藥物釋放越快。人體正常微環(huán)境的pH約為7，而大多數(shù)癌細(xì)胞組織外、細(xì)胞內(nèi)溶酶體等的微環(huán)境是酸性的，有利于DOX的釋放，因此，有很多pH依賴性釋放的報道，以達(dá)到藥物在靶部位定向釋放的目的。如SHEN等[7]利用聚電解質(zhì)膠囊負(fù)載DOX，通過pH控制藥物釋放；XIE等[8]將DOX負(fù)載與介孔二氧化硅，并通過調(diào)節(jié)pH控制藥物釋放速率。這種pH敏感釋放特性能夠促進(jìn)藥物在腫瘤低pH環(huán)境下釋放，從而發(fā)揮更好地腫瘤抑制作用。

本研究制備的納米粒同時具有成像和載藥雙重性能，靜脈注射進(jìn)入體內(nèi)后，可通過熒光觀察其體內(nèi)分布情況，以便了解載體對腫瘤的靶向性，同時載體在腫瘤部位可實現(xiàn)pH敏感釋放，將有利于腫瘤的治療。目前，將載體同時應(yīng)用于成像及藥物傳遞的研究已有較多報道，如NaYF4[9]、CdSe[10]等，但以TiO2作為成像及載體的研究相對較少。此外，由于TiO2具有良好的光催化及超聲催化性能，因此進(jìn)一步探討載藥納米粒的催化治療與化療聯(lián)合應(yīng)用，對該載體在抗腫瘤方面研究具有重要意義。

[1] SMITH A M，MANCINI M C，NIE S M.Second window for in vivo imaging[J].Nat Nanotechnol，2009，4(11)：710-711.

[2] MIKI I，KEI M，NAOYA E，et al.Thermal stability of rutile TiO2 with high specific surface area synthesized by self-Hydrolysis process[J].Sci Adv Mater，2010，2(1)：102-106

[3] NINOMIYA K，OGINO C，OSHIMA S.Targeted sonodyna-mic therapy using protein-modified TiO2nanoparticles[J].Ultrason Sonochem，2012，19(3)：607-614.

[4] YAMAGUCHI S，KOBAYASHI H，NARITA T.Sonodyna-mic therapy using water-dispersed TiO2-polyethylene glycol compound on glioma cells：comparison of cytotoxic mechanism with photodynamic therapy[J].Ultrason Sonochem，2011，18(5)：1197-1204.

[5] YOU J，ZHANG G D，LI C.Exceptionally high payload of doxorubicin in hollow gold nanospheres for near-infrared light-triggered drug release[J].Acs Nano，2010，4(2)：1033-1041.

[6] LIU Z，SUN X M，NAKAYAMA-RATCHFORD N，et al.Su-pramolecular chemistry on water-soluble carbon nanotubes for drug loading and delivery[J].Acs Nano，2007，1(1)：50-56.

[7] SHEN H J，SHI H，MA K.Polyelectrolyte capsules packag-ing BSA gels for pH-controlled drug loading and release and their antitumor activity[J].Acta Biomater，2013，9(4)：6123-6133.

[8] XIE M，SHI H，LI Z.A multifunctional mesoporous silica nanocomposite for targeted delivery，controlled release of doxorubicin and bioimaging[J].Colloids Surf B Biointerfaces，2013，1(110)：138-147.

[9] WANG C，CHENG L，LIU Z.Drug delivery with upconver-sion nanoparticles for multi-functional targeted cancer cell imaging and therapy[J].Biomaterials，2011，32(4)：1110-1120.

[10] KUMAR R，KULKARNI A，NAGESHA D K，et al.Invitroevaluation of theranostic polymeric micelles for imaging and drug delivery in cancer[J].Theranostics，2012，2(7)：714-722.

DOI 10.3870/yydb.2015.06.025

Drug Loading and Release of Titanium Dioxide Nanoparticles with Near-infrared Light

YING Jingyan, XU Airen, RONG Jianhui, MA Weicheng, HE Wenyue

(DepartmentofPharmacy,RenopathyandUrologyHospitalofNingboCity,ZhejiangProvince,Ningbo315100,China)

Objective To prepare titanium dioxide (TiO2) nanoparticles with good near-infrared light and study the loading and release of doxorubicin. Methods The Sm doped TiO2nanoparticles (Sm-TiO2) were synthesized using a modified solvothermal reaction and then observed with transmission electron microscope.The fluorescence spectrum, doxorubicin loading capacity and release profile were also determined. Results The obtained Sm-TiO2nanoparticles with the length from 100-200 nm were fusiform and well dispersed.The emission wavelength was 640-670 nm.The drug loading capacity in water was 11.5%.DOXinvitrowas pH sensitive to release. Conclusion Sm-TiO2nanoparticles have good near-infrared light, high drug loading capacity and controllable drug release are obtained and should be studied further more as a novel carrier.

Titanium dioxide (TiO2)； Drug carrier； Release, pH sensitivity； Near-infrared light

2014-02-24

2014-09-14

*寧波市自然科學(xué)基金資助項目(2012A610182)

應(yīng)景艷(1983-)，女，浙江寧波人，主管藥師，碩士，從事臨床藥學(xué)工作。電話：0574-83039130，E-mail：ffxfly@163.com。

何文躍(1971-)，男，浙江舟山人，副主任藥師，主要從事藥物新制劑研究。電話：0574-83039130，E-mail：hwy710331@sina.com。

R945

B

1004-0781(2015)06-0795-04