高鈺淇,黨麗娟,別小妹,呂鳳霞,趙海珍,陸兆新

(南京農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院,江蘇南京 210095)

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高鈺淇,黨麗娟,別小妹,呂鳳霞,趙海珍,陸兆新*

(南京農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院,江蘇南京 210095)

采用60Co γ射線、硫酸二乙酯(DES)、原生質(zhì)體紫外3種誘變方法對嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)NX2-6進行誘變,以期獲取高產(chǎn)類細菌素菌株。結果表明,60Co γ射線誘變的最佳輻照劑量為2.0kGy,DES處理的最佳條件是濃度為0.7%的DES處理菌體10min,原生質(zhì)體紫外誘變最佳照射時間為20s,分別得到高產(chǎn)菌γ56,D47和UV156,它們的抑菌效價分別為6096.78,5384.98U/mL和6230.79U/mL,是出發(fā)菌株抑菌效價(2819.36U/mL)的2.16、1.91、2.21倍。傳代表明,突變株γ56、D47、UV156具有穩(wěn)定的遺傳性。

60Coγ射線誘變,DES誘變,原生質(zhì)體紫外誘變,穩(wěn)定性

細菌素是由核糖體合成的具有抗菌活性的多肽或蛋白質(zhì),但它的抗菌譜通常較窄[1-2],僅抑制革蘭氏陽性菌,對革蘭氏陰性菌和真菌沒有抑菌活性,而且只有乳酸鏈球菌肽(Nisin)是被美國食品和藥物管理局認證的GRAS(generally recognized as safe)級別的細菌素[3],迄今為止,Nisin已在全世界很多國家和地區(qū)被用作食品防腐劑。類細菌素是指不符合或不完全符合細菌素定義的拮抗物質(zhì)[4],類細菌素具有廣譜抗菌特性,不僅能抑制革蘭氏陽性菌,而且對革蘭氏陰性菌和真菌也有抑制作用。

本實驗室保藏了一株產(chǎn)類細菌素的嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)NX2-6[5],但其產(chǎn)量不是很高。通過遺傳改良選育高產(chǎn)菌株,是提高其類細菌素產(chǎn)量的關鍵。解西玉[6]等用60Coγ射線對曲酸生產(chǎn)菌進行誘變選育高產(chǎn)菌,產(chǎn)量提高292.2%。常峰等[7]對類細菌素高產(chǎn)菌布式乳桿菌CF10經(jīng)紫外線照射(UV)和硫酸二乙酯(DES)多輪復合誘變,CF10發(fā)酵液相對效價較未誘變前提高了258%且具有良好的傳代穩(wěn)定性。湯斌等[8]以米曲霉3.042為出發(fā)菌株,對其原生質(zhì)體進行紫外誘變,篩選得到蛋白酶活力提高1.8倍的高產(chǎn)菌株。本實驗通過60Co γ射線誘變、DES誘變、原生質(zhì)體紫外誘變篩選出3株類細菌素高產(chǎn)且穩(wěn)定遺傳的菌株,為后續(xù)類細菌素的進一步研究打好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

出發(fā)菌株:嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)NX2-6,由南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院酶工程實驗室保藏；指示菌:藤黃微球菌(CMCC 28001)；脫脂乳培養(yǎng)基:脫脂乳10.0g,酵母浸出粉(OXOID)0.1g,蒸餾水90mL,121℃,滅菌7min；NA:牛肉浸膏3.0g,魚粉蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,瓊脂1.8～2.0g,水1000mL,121℃,滅菌20min；MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨(SCRC)10.0g,牛肉浸 8.0g,酵母浸出粉(OXOID)4.0g,葡萄糖20.0g,吐溫-80 1.0g,KH2PO4·3H2O 2.0g,乙酸鈉5.0g,MgSO4·7H2O 200.0mg,MnSO4·H2O 40.0mg,檸檬酸氫二銨2.0g,蒸餾水1000mL,pH 5.7,121℃,滅菌15min；MRS固體培養(yǎng)基:MRS液體培養(yǎng)基中加入瓊脂18～20g/L；2%(v/v)硫酸二乙酯(DES):2mL硫酸二乙酯(DES)原液加入9.8mL無水乙醇；高鹽緩沖液:含0.6mol/L NaCl的0.05mol/L pH7.0的磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液；再生培養(yǎng)基:MRS固體培養(yǎng)基中加入2%葡萄糖,0.2mol/L蔗糖,15mmol/L MgCl2,pH6.5；溶菌酶液:用高鹽緩沖液配制溶菌酶液,濃度為100mg/mL。

超凈臺(SW-CJ-IBU) 蘇凈集團安泰公司；pH計(Orion 3-Star) 美國Thermo公司；飛鴿牌系列離心機 上海安亭科學儀器廠；高壓蒸氣滅菌鍋 日本TOMY公司；恒溫干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(PYX-DHS-50X65) 上海躍進醫(yī)療器械廠；電子天平(AY120) 日本島津公司；游標卡尺 上海恒量量具有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Nisin標準效價曲線的測定 準確稱取0.16g Nisin標準品(106U/g,美國Sigma公司產(chǎn)品)溶于10mL的0.02mol/L的稀鹽酸中,配成濃度為16000U/mL的Nisin標準液備用,再用0.02mol/L的稀鹽酸分別稀釋至8000、4000、2000、1000、500、250U/mL,采用管碟法測定Nisin標準品對濃度為106CFU/mL的藤黃微球菌抑菌圈直徑,繪制Nisin效價的對數(shù)值和抑菌圈直徑之間關系的標準曲線[9]。從而根據(jù)實驗菌株類細菌素抽提液對藤黃微球菌的抑菌圈直徑換算出類細菌素的效價。實驗所得的嗜酸乳桿菌NX2-6類細菌素的效價等同于對藤黃微球菌具有相同抑菌效果的Nisin標準品的效價[7,10]。

1.2.2 菌懸液的制備 將出發(fā)菌以2%接種量移入50mL脫脂乳培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12h待凝乳,再以2%接種量移入50mL液體MRS培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)10～12h,傳代2次后培養(yǎng)至對數(shù)末期。

1.2.360Co γ射線誘變 取14支滅菌的離心管,每管分別裝入新制備的菌懸浮液1mL。輻射劑量分別為0.2、0.4、0.5、1、1.5、2.0、3.0kGy。將每管進行稀釋,取0.1mL涂平板,37℃培養(yǎng),計平板菌落數(shù),分別計算致死率和正突變率。

1.2.4 硫酸二乙酯(DES)誘變 取20mL菌懸液離心洗滌2次,用不同濃度的硫酸二乙酯處理10、15、30min后,取0.5mL處理液,加入到4.5mL 1% Na2S2O3液中解毒,稀釋后取0.1mL涂平板,37℃培養(yǎng)[11],計平板菌落數(shù),分別計算存活率和正突變率。

1.2.5 原生質(zhì)體制備與再生 將出發(fā)菌以2%接種量移入50mL脫脂乳培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12h待凝乳,再以2%接種量移入50mL液體MRS培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12h,然后以10%接種量移入50mL含有0.01g甘氨酸的液體MRS培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)6h,調(diào)整其OD600值在0.2左右。取上述菌液10mL于離心管中,12000r/min離心5min收集菌體,將收集到的菌體用高鹽緩沖液洗滌兩次,重懸于等體積高滲體系中。取一定量的菌體梯度稀釋后涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板計數(shù),得到總菌落數(shù)。取5mL菌體液加入不同濃度的溶菌酶37℃水浴鍋中酶解一定時間后迅速加入大量高鹽緩沖稀釋終止酶解反應,3000r/min離心18min去酶,用高鹽緩沖液洗滌兩次以清除殘存酶液并重懸于等體積高滲體系中,稀釋合適的倍數(shù),涂布再生平板,得到再生菌落數(shù)。用水代替高鹽緩沖液稀釋等量原生質(zhì)體液,涂布MRS固體培養(yǎng)基平板計數(shù),得到未酶解菌落數(shù)。

原生質(zhì)體形成率和再生率的計算[12]:

原生質(zhì)體形成率(%)=(A-B)/A×100

原生質(zhì)體再生率(%)=(C-B)/(A-B)×100

其中:A:總菌落數(shù)；B:未被酶解菌落數(shù)；C:再生菌落數(shù)。

1.2.6 原生質(zhì)體紫外誘變 取2～3mL原生質(zhì)體液置于放有大頭針的無菌6cm培養(yǎng)皿中,在磁力攪拌作用下距18W紫外燈25cm處分別照射5、10、15、20、30、40、60s,對每個處理進行梯度稀釋,取0.1mL涂布于再生平板培養(yǎng)基上,37℃避光培養(yǎng),計平板菌落數(shù),分別計算致死率和正突變率。

1.2.7 致死率和正突變率的計算 將培養(yǎng)好的平板取出進行菌落計數(shù),根據(jù)平板上菌落計數(shù)結果,計算致死率；根據(jù)抑菌圈測定結果,計算正突變率[13]。

致死率(%)=(未處理平板菌落數(shù)-處理平板菌落數(shù))/未處理平板菌落數(shù)×100

正突變率(%)=抑菌效果增大的菌落數(shù)/誘變后長出的菌落總數(shù)×100

1.2.8 高產(chǎn)菌株的篩選 待菌落長出后,用滅菌后牙簽隨機挑取單菌落至1mL MRS液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)48h后離心取上清液,用打孔法測定其對藤黃微球菌的抑菌效果。將出發(fā)菌和抑菌圈直徑較大的菌株活化,制取其類細菌素抽提液[5]。類細菌素抽提液低溫保存?zhèn)溆?測定其抑菌活性。

1.2.9 高產(chǎn)菌株穩(wěn)定性遺傳 將篩選出的類細菌素產(chǎn)量突變菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接100代[14-15],分別測定各代菌株類細菌素抽提液抑菌效果,以測定其遺傳穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 Nisin標準曲線

由于目前對乳酸菌類細菌素的研究都尚在實驗階段,沒有標準品參照,而乳酸鏈球菌肽(Nisin)是被美國食品和藥物管理局認證的GRAS(generally recognized as safe)級別的細菌素,對其各方面的研究都較為透徹也具有權威性,本研究以Nisin效價作為參照指標,Nisin效價的對數(shù)作為縱坐標,抑菌圈直徑為橫坐標,做抑菌標準曲線。由圖1可見,標準效價的對數(shù)與抑菌圈直徑之間呈線性關系,相關系數(shù)為0.99,符合進一步實驗的要求。

圖1 Nisin標準效價曲線Fig.1 The standard titer curve of Nisin

2.2 60Co γ射線誘變

2.2.160Co γ射線誘變劑量的確定 菌懸液經(jīng)0～3.0kGy的γ射線劑量對出發(fā)菌株NX2-6進行輻照誘變,結果如圖2所示。

圖2 紫外照射對菌株致死率及正突變率的影響Fig.2 Effects of 60Co γ irradiation death rate and positive mutation rate

從圖2可以看出,隨著γ射線輻照劑量的增加,致死率呈上升趨勢,正突變率呈先上升后下降趨勢。由于60Co γ能使生物染色體斷裂而引起基因易位、倒位或缺失等結構變化,并對各種生物大分子造成不可修復的損傷,引起微生物遺傳性狀的改變[16],因此過高劑量的輻射會對菌體有明顯的致死效果,并且此時的負突變率較高,不利于高產(chǎn)菌株的篩選。在輻照劑量為3.0kGy時,達到最大致死率為99%,但此時正突變率較低為6.1%；在輻照劑量為2.0kGy時,其致死率為58%,達到最大正突變率為8.5%,此時不但利于篩選工作的進行,而且正突變率高更利于高產(chǎn)菌株的獲得。故2.0kGy為最佳輻照劑量。

2.2.260Co γ射線誘變的篩選結果 嗜酸乳桿菌NX2-6經(jīng)60Co γ射線誘變后,隨機挑取200株菌落,經(jīng)過初篩和復篩得到3株高產(chǎn)菌γ56、γ77和γ103,參照Nisin標準效價曲線計算其抑菌效價分別為6096.78、4293.39、5065.24U/mL,比出發(fā)菌株抑菌效價(2819.36U/mL)提高了2.16、1.52、1.8倍?？梢钥闯?經(jīng)60Co γ射線誘變后的菌株較出發(fā)菌株抑菌效價有明顯提高,說明所設定的照射劑量有利于高產(chǎn)菌株的獲得,選擇突變幅度最大的菌株γ56進行穩(wěn)定性遺傳實驗。

表1 60Co γ射線誘變的篩選結果Table1 Selection for 60Co γ irradiation

2.3 DES誘變

2.3.1 DES誘變劑量的確定 菌懸液經(jīng)不同濃度的硫酸二乙酯處理不同時間后取樣稀釋涂布于MRS平板計數(shù),得到致死率及正突變率如圖3所示。

圖3 DES誘變對菌株致死率及正突變率的影響Fig.3 Effects of DES death rate and positive mutation rate

由圖3可以看出,隨硫酸二乙酯濃度及處理時間的增加,菌體的致死率逐漸增大；濃度為0.3%和0.5%時正突變率隨處理時間的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,當濃度為0.7%時正突變率呈逐漸降低的趨勢,可能由于高濃度的硫酸二乙酯對菌體的烷化作用[17]更為明顯,短時間內(nèi)就使菌體發(fā)生了誘變反應。當DES濃度為0.3%處理時間30min后,最大致死率為30%,在處理20min時,正突變率達到最大值為2.7%；當DES濃度為0.5%處理時間30min后,最大致死率為88%,正突變率在處理20min時最大為6.8%；當DES濃度為0.7%處理時間30min后,最大致死率為99.4%,在處理10min時,正突變率最大為7.8%。綜合考慮,選擇DES濃度為0.7%,處理菌體10min作為最佳誘變條件。

2.3.2 DES誘變的篩選結果 菌株經(jīng)DES誘變后,隨機挑取300株菌落,經(jīng)過篩選得到3株高產(chǎn)菌D16、D47和D123,參照Nisin標準效價曲線計算其抑菌效價分別為3845.92、5384.98、5131.24U/mL,比出發(fā)菌株抑菌效價(2819.36U/mL)提高了1.36、1.91、1.82倍。從表2可以看出,經(jīng)DES誘變后得到的高產(chǎn)菌較出發(fā)菌株抑菌效價有一定提高,說明所設定的誘變劑量有利于高產(chǎn)菌株的獲得,選擇突變幅度最大的菌株D47進行穩(wěn)定性遺傳實驗。

表2 DES誘變的篩選結果Table2 Selection for diethyl sulphate mutagenesis

2.4 原生質(zhì)體紫外誘變

2.4.1 原生質(zhì)體制備及再生 對出發(fā)菌株原生質(zhì)體制備及再生條件的摸索和優(yōu)化,出發(fā)菌株的原生質(zhì)體形成率達99.9%,再生率為56.2%,有較好的形成率及再生率。

2.4.2 原生質(zhì)體紫外誘變劑量的確定 經(jīng)原生質(zhì)體化的菌株比較脆弱,因此本實驗選擇5～60s的紫外線照射進行誘變,結果如圖4所示。

圖4 原生質(zhì)體誘變對菌株致死率及正突變率的影響Fig.4 Effects of protoplast mutagenesis of ultraviolet irradiation death rate and positive mutation rate

從圖4可以看出,隨著紫外線照射時間的延長,致死率明顯上升,正突變率呈先梯度上升后下降的趨勢；由于去除細胞壁后原生質(zhì)體比較脆弱,因此對照射時間更為敏感。當照射時間為60s時,達到最大致死率為99.9%；當照射時間為20s時,致死率為67.9%,此時的正突變率最高為10.2%,不僅利于菌株的篩選,并且更容易獲得高產(chǎn)菌株,故20s為實驗菌株的最佳照射時間。

2.4.3 原生質(zhì)體紫外誘變篩選結果 乳桿菌NX2-6經(jīng)原生質(zhì)體紫外誘變后,隨機挑取180株菌落進行發(fā)酵,經(jīng)過初篩和復篩得到3株高產(chǎn)菌UV6、UV27和UV156,參照Nisin標準效價曲線計算其抑菌效價分別為5441.36、5074.85、6230.79U/mL,比出發(fā)菌株抑菌效價(2819.36U/mL)提高了1.93、1.8、2.27倍。目前,不少學者利用紫外誘變篩選高產(chǎn)類細菌素的突變株,但是通過原生質(zhì)體誘變選育優(yōu)良菌株的報道還很少。由于去除了細胞壁,原生質(zhì)體對誘變劑更加敏感,更容易得到優(yōu)良的突變株[17]。由表3可以看出,經(jīng)原生質(zhì)體紫外誘變后得到的突變菌株較出發(fā)菌株抑菌效價有明顯提高,說明原生質(zhì)體紫外誘變是一種有效的誘變方法,并且該實驗所選擇的照射時間梯度有利于高產(chǎn)菌株的獲得。選擇突變幅度最大的菌株UV156進行穩(wěn)定性遺傳實驗。

表3 原生質(zhì)體誘變的篩選結果Table3 Selection for protoplast mutagenesisof ultraviolet irradiation

2.5 高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性

選取抑菌效價增幅最大的三株高產(chǎn)菌γ56、D47、UV156進行遺傳穩(wěn)定性實驗,在連續(xù)傳代100代后[18],這三株菌的類細菌素抽提液對藤黃微球菌的抑菌效價如圖5所示。從圖中可以看出,當菌株傳代100代后抑菌效價變化幅度不大,說明這三株菌有較好的遺傳穩(wěn)定性,可作為后續(xù)實驗的出發(fā)菌株。

圖5 出發(fā)菌株、γ56、D47、UV156每代的抑菌效價Fig.5 The antibacterial titer of every generation by initial strain、γ56、D47、UV156

3 結論

從自然條件篩選的野生型菌株往往產(chǎn)量不高,達不到生產(chǎn)要求,而且生產(chǎn)能力一般較不穩(wěn)定,隨著接種代數(shù)的增多,產(chǎn)量下降甚至喪失的情況多有發(fā)生。在工業(yè)生產(chǎn)中常用誘變育種的方法獲得突變株,提高其產(chǎn)量[19]。本實驗選擇三種誘變方法對嗜酸乳桿菌NX2-6進行誘變,確定了每種誘變方法的最佳誘變條件,并獲得三株高產(chǎn)菌。

60Co γ射線誘變的最佳輻照劑量為2.0kGy,獲得一株類細菌素高產(chǎn)菌γ56,其抑菌活性為出發(fā)菌株的2.16倍；選擇DES濃度為0.7%,處理菌體10min作為DES誘變最佳條件,得到一株高產(chǎn)菌D47,其抑菌活性為出發(fā)菌株的1.91倍；原生質(zhì)體紫外誘變的最佳照射時間為20s,獲得一株類細菌素高產(chǎn)菌UV156,其抑菌活性為出發(fā)菌株的2.21倍。通過實驗數(shù)據(jù)可以看出,本實驗選擇的三種誘變方法中原生質(zhì)體紫外誘變更適用于該菌株,可能由于去除了細胞壁后的原生質(zhì)體對輻照誘變更為敏感,更容易誘變得到高產(chǎn)菌株。對突變株γ56、D47、UV156進行遺傳穩(wěn)定性實驗,結果表明其遺傳穩(wěn)定性良好,為今后類細菌素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定良好基礎。

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Different mutation methods ofLactobacillusacidophilusNX2-6 for improving antifungal activity

GAO Yu-qi,DANG Li-juan,BIE Xiao-mei,LV Feng-xia,ZHAO Hai-zhen,LU Zhao-xin*

(College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

LactobacillusacidophilusNX2-6 was mutated by60Co γ irradiation,DES and UV of protoplasts respectively,aiming to obtain high productivity of bacteriocins stains. The results showed that the optimal condition of60Co γ irradiation was 2.0kGy,the best mutant condition of DES was the concentration of 0.7% to treat bacteria for 10min,and the UV of protoplasts best irradiation time was 20s. Then high productivity strains γ56,D47and UV125were screened respectively. Moreover,their antibacterial titers were 6096.78,5384.98U/mL and 6230.79U/mL. The antibacterial titers of γ56,D47,UV156was 2.16,1.91,2.21 times than the initial strain(2819.36U/mL)respectively. The bacteria passage test indicates that mutant strains γ56,D47,UV156have the sTableheredity.

60Co γ irradiation;diethyl sulphate mutagenesis;protoplast mutagenesis of ultraviolet irradiation；stability

2014-07-09

高鈺淇(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：微生物代謝與發(fā)酵工程。

國家科技部支撐計劃(2011BAD23B05)。

TS202.3

A

:1002-0306(2015)09-0184-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.032

*通訊作者:陸兆新 (1957-)，男，博士，研究方向：酶工程、食品微生物、農(nóng)產(chǎn)品加工。