閆倩云,李玲玲,叢方地，*,劉海臣,周學(xué)永,邢克智,孔新月,趙 瑞

(1.天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院,天津 300384；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼 028042)

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固定化脂肪酶生物反應(yīng)器催化合成乙酸正己酯

閆倩云1,李玲玲1,叢方地1，*,劉海臣2,周學(xué)永1,邢克智1,孔新月1,趙 瑞1

(1.天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院,天津 300384；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼 028042)

為提高非水相酶促合成食品添加劑乙酸正己酯的效率,以羧甲基纖維素為穩(wěn)定劑,通過物理吸附,將假單胞菌脂肪酶Pseudomonascepacialipase固定在錐形瓶?jī)?nèi)壁上,制備成簡(jiǎn)易的生物反應(yīng)器,并研究了其用于催化合成乙酸正己酯的動(dòng)力學(xué)。結(jié)果表明,在反應(yīng)器中,加入己醇與乙酸乙烯酯的混合液,并在37℃、150r/min下?lián)u動(dòng),反應(yīng)即開始；反應(yīng)液倒出,則反應(yīng)停止,無(wú)需過濾。反應(yīng)7h,相對(duì)于酶粉,反應(yīng)器中的固定化酶,可使反應(yīng)轉(zhuǎn)化率提高7倍,48h后,轉(zhuǎn)化率達(dá)99%。經(jīng)10次循環(huán)催化、共10d與有機(jī)相的接觸,仍保留有52%的轉(zhuǎn)酯活性；同樣條件下,不添加羧甲基纖維素的固定化酶,僅有12.8%的活性?？梢?這種反應(yīng)器操作方便,能有效提高酶的非水活性和穩(wěn)定性,適于催化非水相反應(yīng)。

乙酸正己酯,假單胞菌脂肪酶,固定酶生物反應(yīng)器,非水相

低分子量的脂類具有濃郁的水果香味,是食品行業(yè)常用的食用香精,如,乙酸正己酯具有香蕉香味,可用于飲料、甜點(diǎn)和烘烤食品中[1]。乙酸正己酯的傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)采用化學(xué)催化劑,如濃硫酸、金屬鹽、超強(qiáng)酸等,在較高溫度下催化合成,但是通常會(huì)有副產(chǎn)物,并不可避免地造成環(huán)境污染[2-4]。因而,環(huán)境友好的生物催化方法,特別是非水相酶催化合成,更受到人們青睞。如,超臨界條件下的脂肪酶酶催化、固定化脂肪酶酶催化轉(zhuǎn)酯、吸水劑輔助固定化脂肪酶酶催化等[5-7]。在近乎無(wú)水的非水相中的酶催化反應(yīng),不但反應(yīng)條件溫和,而且副反應(yīng)減少,非常有利于催化在水相中不穩(wěn)定的底物分子[8-9]。脂肪酶的催化特性是界面催化作用,即在水/油(有機(jī)相)上,表現(xiàn)出優(yōu)異的催化作用,但在有機(jī)相中催化活性明顯降低,且活性的穩(wěn)定性差[10-11]。因?yàn)橹久傅幕钚圆课煌ǔ１灰欢桅?螺旋覆蓋,被稱為蓋子結(jié)構(gòu)[12]。在界面上,脂肪酶一方面可以被水相優(yōu)化,保持優(yōu)勢(shì)蛋白構(gòu)象；另一方面蓋子被有機(jī)相打開,使之具有較好的催化活性,即所謂的界面活化機(jī)制[13]。在純有機(jī)相中,酶蛋白通常會(huì)被有機(jī)溶劑變性而失活,因而活性偏低、且不穩(wěn)定[11]。所以,提高非水相酶促合成乙酸正己酯的效率,應(yīng)模擬脂肪酶的界面活化機(jī)制,提高酶的催化活性。為此,我們?cè)谝延醒芯康幕A(chǔ)上[5-6,14],以羧甲基纖維素(Carboxymethyl cellulose,CMC)為穩(wěn)定劑,通過物理吸附,將脂肪酶Pseudomonascepacialipase(PCL)固定在錐形瓶?jī)?nèi)壁上,形成一種簡(jiǎn)易的生物反應(yīng)器,并用于催化己醇與乙酸乙烯酯的轉(zhuǎn)酯反應(yīng),收到了較好的催化效果。

表1 底物體積比對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Table1 Effect of substrate volume ratio on conversion

表2 反應(yīng)液體積對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Table2 Effect of reaction solution volume on conversion

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PCL酶粉 購(gòu)于日本天野制藥株式會(huì)社(33U/mg)；CMC 由施瑞客(天津)生物技術(shù)有限公司提供；正己醇、乙酸乙烯酯及其他試劑 皆為分析純。

固定化操作和催化反應(yīng)所用儀器為恒溫?fù)u床 HZQ-X,哈爾濱;動(dòng)力學(xué)分析儀器為氣相色譜儀 儀盟 A90,上海;配有氫火焰檢測(cè)器和毛細(xì)管柱(SE-30 30m×0.32mm×0.33μm)。

1.2 PCL生物反應(yīng)器的制備方法

參考以前的研究[15-16],選擇PCL作為轉(zhuǎn)酯催化劑。為實(shí)驗(yàn)方便,選用10mL的錐形瓶作為固定化容器。加入10mg的酶粉和0.2mL的水(或0.05%的CMC水溶液),在搖床中,固定化條件為:敞口、37℃、150r/min、10h,恰好可以使酶均勻地吸附在錐形瓶的內(nèi)壁上,形成簡(jiǎn)易的固定化PCL酶生物反應(yīng)器。

1.3 反應(yīng)器催化轉(zhuǎn)酯及活化方法

固定化PCL酶生物反應(yīng)器中,加入一定體積的正己醇與乙酸乙烯酯的混合物,蓋磨口塞并用封口膜密封,在搖床中,在37℃和150r/min的條件下催化反應(yīng)。反應(yīng)液一旦倒出反應(yīng)器,反應(yīng)即刻停止,反應(yīng)液無(wú)需過濾,即可用于分析。反應(yīng)器用少量石油醚沖洗后,可繼續(xù)用于下次催化反應(yīng)。多次使用后的反應(yīng)器,經(jīng)石油醚洗滌后,再加入0.2mL水,重復(fù)前述固定化方法,可使衰減的酶活性重新恢復(fù)。

1.4 轉(zhuǎn)酯動(dòng)力學(xué)分析方法

反應(yīng)器中,轉(zhuǎn)酯反應(yīng)一段時(shí)間后的反應(yīng)液,取出20μL,用0.5mL的正己烷稀釋,用于氣相色譜(Gas chromatography,GC)分析。如果是酶粉催化,用0.25μm的濾膜過濾,取出20μL,用0.5mL的正己烷稀釋,用于氣相色譜分析。氣相色譜條件,氮?dú)鉃檩d氣(0.4MPa,分流比20∶1)。分析程序:135℃保留1min,以50℃/min升溫到200℃,并保留2min。進(jìn)樣和檢測(cè)溫度分別為280℃和300℃。底物的轉(zhuǎn)化率,通過比較正己醇和乙酸正己酯的峰面積得出[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCL生物反應(yīng)器與反應(yīng)體系

因?yàn)槊甘堑鞍踪|(zhì),具有親水性,因此酶在玻璃壁上吸附牢固,用于催化反應(yīng)時(shí),在150r/min的條件下,搖動(dòng)的有機(jī)相不能將酶從瓶壁上剝落,優(yōu)于酶在非極性載體上的固定化,酶與非極性載體結(jié)合不夠牢固,容易在使用中脫落[14]；當(dāng)然,這種反應(yīng)器不適于催化水相反應(yīng)。反應(yīng)底物為正己醇,在PCL酶催化下,與酰化試劑乙酸乙烯酯轉(zhuǎn)酯生成乙酸正己酯,同時(shí)生成的乙烯醇自發(fā)異構(gòu)為乙醛,借此拉動(dòng)反應(yīng)不可逆地進(jìn)行[5]。該無(wú)溶劑非水反應(yīng)體系,沒有水的參與和生成,所以不必考慮溶液pH影響。反應(yīng)后減壓蒸餾,即可除去剩余的乙酸乙烯酯和乙醛,得產(chǎn)物。使用10mg 的PCL酶粉,首先催化2mL反應(yīng)液反應(yīng)12h,根據(jù)轉(zhuǎn)化率,并考慮到盡可能地減少?；噭┑挠昧?確定正己醇和乙酸乙烯酯的體積比為1∶1(表1)。然后,在這個(gè)比例下,改變它們的用量,根據(jù)轉(zhuǎn)化率,并考慮到盡可能地提高酶催化反應(yīng)液的體積,確定反應(yīng)液中正己醇和乙酸乙烯酯的體積皆為1.5mL(表2)。同時(shí),從轉(zhuǎn)化率可以看出酶粉的活性較低(表1)。

2.2 PCL固定化中水的作用

根據(jù)脂肪酶的界面活性和已報(bào)到的研究,可知酶的活性與其構(gòu)象密切相關(guān),而酶構(gòu)象與其結(jié)合的必需水分子的數(shù)量相關(guān)[14,17-18]。進(jìn)一步的研究揭示,必需水分子的作用是維持酶蛋白的正確構(gòu)象,以激活酶[19]。以此為依據(jù),我們以少量水為溶劑,通過固定化操作,將10mg PCL吸附在錐形瓶?jī)?nèi)壁上,多余的水分經(jīng)揮發(fā)除去。結(jié)果表明,在反應(yīng)前期,酶生物反應(yīng)器中的PCL催化反應(yīng)7h,底物轉(zhuǎn)化率為39.9%,相對(duì)于酶粉催化反應(yīng)底物轉(zhuǎn)化率5.4%,提高了7倍多；生物反應(yīng)器催化反應(yīng)48h,轉(zhuǎn)化率≥99%,而酶粉催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率<20%(圖1)。從氣相色譜圖可以看到,兩種形式酶的活性差別顯著,7h后,PCL生物反應(yīng)器中,2.23min處的產(chǎn)物乙酸正己酯的峰較大,而酶粉催化的反應(yīng)體系中,產(chǎn)物峰不明顯(圖2)。如果將酶從器壁上小心地刮掉,用于催化反應(yīng),酶的活性類似于固定化酶；或者向使用多次、活性衰減的固定化酶中,加入少量水,重復(fù)固定化操作,酶的非水活性可以重新激活。這說明,酶激活,主要是水的修飾作用。固定化時(shí),水的作用類似于界面上水相的作用,優(yōu)化了酶的構(gòu)象；用于催化時(shí),反應(yīng)液相當(dāng)于界面上的有機(jī)相的作用,酶活性部位上的蓋子被打開,表現(xiàn)出較高的催化活性[13]。即酶生物反應(yīng)器催化非水反應(yīng),相當(dāng)于分步模擬了脂肪酶的界面活性。然而,由于不存在水油界面,這種模擬,卻難于長(zhǎng)期保持其催化活性,這種固定化PCL,在催化24h后,再次催化時(shí),從底物的轉(zhuǎn)化率來看,催化活性降低幅度較大,催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率平均每次降低8.3%,10次催化、共10d與有機(jī)相的接觸,催化活性僅為最初的12.8%(最后一次催化底物轉(zhuǎn)化率11.1%與首次催化底物轉(zhuǎn)化率的比率86.6%)(圖 3)。原因是,酶長(zhǎng)時(shí)間與有機(jī)相的接觸,酶必要的水分子被有機(jī)相帶走,而被變性,失去優(yōu)勢(shì)構(gòu)象,因而活性降低[11]。顯然,要維系酶的活性,就要進(jìn)一步穩(wěn)定酶的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象。

表3 CMC濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響(催化反應(yīng)時(shí)間24h)Table3 Effect of CMC concentration on conversion(reaction catalyzed for 24h)

圖1 PCL酶粉與水修飾固定化PCL的催化動(dòng)力學(xué)Fig.1 Kinetics of transesterification catalyzed by native and water-modified immobilized PCL

圖2 PCL酶粉與水修飾PCL催化反應(yīng)體系的GC(7h) Fig.2 GC analysis on reaction mixture catalyzed by water-modified and native PCL after 7 h注：a.正己醇1.94min；b.乙酸正己酯2.23min。

圖3 水修飾PCL催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)轉(zhuǎn)化率(24h/次)Fig.3 Conversions of reactions catalyzed by water-modified immobilized PCL for 24h each time

2.3 CMC對(duì)PCL活性的穩(wěn)定化

從蛋白質(zhì)涂層微晶研究得到啟示,可以使用水性大分子穩(wěn)定PCL構(gòu)象[20]?；贑MC的水溶性和大分子結(jié)構(gòu)[21],CMC被選作穩(wěn)定劑,用于穩(wěn)定PCL的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象,延長(zhǎng)其催化活性。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CMC濃度過低不足以維持酶的構(gòu)象,濃度過高會(huì)阻礙底物分子進(jìn)入活性部位,0.2mL 0.05% CMC的溶液適合固定化使用(表3)。在固定化時(shí),用0.2mL 0.05% CMC 溶液代替同體積的水,用于固定化PCL,則得CMC穩(wěn)定化的PCL酶生物反應(yīng)器。與單純使用水固定化相比,CMC穩(wěn)定化的PCL固定化酶的催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與之相近,即活性相近(圖4)。但是CMC使酶在有機(jī)相中的穩(wěn)定性明顯升高,24h的催化后,再次催化時(shí),酶催化活性的衰減明顯降低,催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率平均每次降低4.7%,10次催化、共10d與有機(jī)相的接觸,催化活性仍保留最初的52%(最后一次催化底物轉(zhuǎn)化率46.0%與首次催化底物轉(zhuǎn)化率的比率88.6%)(圖5)。氣相色譜圖顯示,每次催化24h,第10次催化后,僅用水修飾的PCL催化轉(zhuǎn)酯合成乙酸正己酯的色譜峰較弱,而CMC穩(wěn)定的PCL催化轉(zhuǎn)酯合成乙酸正己酯的色譜峰依然較強(qiáng)(圖6)?？梢?相對(duì)于僅使用水固定化,CMC穩(wěn)定化的PCL酶生物反應(yīng)器,其催化作用的穩(wěn)定性明顯升高；同樣,多次使用后,酶活性也可通過加入0.2mL水,重復(fù)固定化操作,使之恢復(fù)。這種酶生物反應(yīng)器制備方便,操作簡(jiǎn)便,催化活性和穩(wěn)定性不亞于報(bào)道的固定化酶[22]。相對(duì)于酶在非極性材料上的固定化[14,23],這種CMC穩(wěn)定的固定化酶更為穩(wěn)定；從界面活化機(jī)理的角度來看[13],這種酶固定化及其在非水相中的應(yīng)用,是對(duì)脂肪酶界面活性的分步模擬,第一步通過固定化以水分子優(yōu)化和CMC穩(wěn)定化酶的構(gòu)象,第二步依靠反應(yīng)相的疏水作用打開酶活性部位上的蓋子,激活酶；可見,制備的固定化脂肪酶生物反應(yīng)器具有更大的應(yīng)用潛力。

圖4 CMC穩(wěn)定與水修飾固定化PCL的催化動(dòng)力學(xué)Fig.4 Kinetics of transesterification catalyzed by CMC-stabilized and water-modified immobilized PCL

圖5 CMC穩(wěn)定PCL催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)轉(zhuǎn)化率(24h/次)Fig.5 Conversions of reactions catalyzed by CMC-stablized immobilized PCLfor 24h each time

3 結(jié)論

固定化脂肪酶PCL生物反應(yīng)器,制備方便,操作便利,酶與反應(yīng)液的分離,只需將液體倒出即可,無(wú)需過濾。反應(yīng)器中酶的活性相對(duì)于酶粉,從底物的轉(zhuǎn)化率來看,反應(yīng)初期7h后,轉(zhuǎn)化率提高了7倍。而且,因CMC的存在,酶對(duì)有機(jī)相的耐受性增強(qiáng),活性穩(wěn)定。催化48h后,轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%,產(chǎn)物容易分離提純。本文的研究為乙酸正己酯的生物合成提供了一種綠色、簡(jiǎn)易,而又有效的途徑；今后,穩(wěn)定脂肪酶構(gòu)象方法和分子機(jī)制的研究,還需要深入,進(jìn)一步推進(jìn)乙酸正己酯的生物工業(yè)技術(shù)生產(chǎn)進(jìn)程。

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Catalyzed synthesis of hexyl acetate in immobilized lipase bioreactor

YAN Qian-yun1,LI Ling-ling1,CONG Fang-di1,*,LIU Hai-chen2,ZHOU Xue-yong1,XING Ke-zhi1,KONG Xin-yue1,ZHAO Rui1

(1.College of Basic Science,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China;2.College of Life Sciences,Inner Mongolia University for Nationalities,Tongliao 028042,China)

To efficiently improve lipase-catalyzed synthesis of food additive hexyl acetate in nonaqueous phase,a simple bioreactor was prepared by immobilizingPseudomonascepacialipase on inner wall of conical flask via physical adsorption and with carboxymethyl cellulose as stabilizer,and used in catalyzed synthesis of hexyl acetate. Results showed that the reaction began after hexanol and vinyl acetate added in this reactor at 37℃ and 150r/min,and the reaction stopped once reaction mixture powered off it. Comparing with lipase power,the immobilized lipase in bioreactor could cause 7-fold increase in transesterification conversion rate of hexanol reacting with vinyl acetate after 7h. After 48h,the conversion achieved more than 99%. Moreover,stability of lipase also was obviously strengthened for CMC-stabilized immobilization. After ten times of catalyzed recycles,total ten days of contacting with organic phase,CMC-stabilized immobilized lipase still kept 52% of transesterification activity. And under the same of conditions,water-modified immobilized lipase only left 12.8% of transesterification activity. It was obvious that the reactor was not only easy in operation but also available in enhancement of enzymatic activity and stability,fitting in nonaqueous catalysis.

Hexyl acetate;Pseudomonascepacialipase;immobilized enzyme bioreactornonaqueous phase;nonaqueous phase

2014-07-24

閆倩云(1991-)，女，學(xué)士，從事生物制藥方向的研究。

*通訊作者:叢方地(1968-)，男，博士，副教授，從事生物催化方向的研究。

天津市國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310061017)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31070478)。

TS202.3

A

:1002-0306(2015)09-0171-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.029