周雅琳,馮 霞,朱 凱,趙 欣

(重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程系,重慶 400067)

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苦丁茶葉制蟲茶粗多酚對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效果

周雅琳,馮 霞,朱 凱,趙 欣*

(重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程系,重慶 400067)

茶多酚是茶葉中的功能性成分。蟲茶作為傳統(tǒng)飲品也含有這些化合物,這些多酚類物質(zhì)的抗癌效果有待科學(xué)的研究。本研究對(duì)苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)的癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用進(jìn)行了測(cè)定。采用MTT法對(duì)CPKMI對(duì)癌細(xì)胞的體外生長抑制作用進(jìn)行了分析,然后進(jìn)一步采用RT-PCR檢測(cè)對(duì)CPKMI的癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過25、50和100μg/mL的CPKMI處理癌細(xì)胞48h,HepG2人肝癌細(xì)胞的增殖被抑制,其中100μg/mL的CPKMI表現(xiàn)出最高的抑制率(72.8%)。CPKMI也可以通過上調(diào)caspase-3、caspase-9、p53、p21、E2F1、p73和下調(diào)HIAP-1,HIAP-2基因的mRNA的表達(dá)對(duì)HepG2癌細(xì)胞起到顯著的凋亡誘導(dǎo)效果(p<0.05)。由此可見,CPKMI表現(xiàn)出強(qiáng)的體外癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效果。

蟲茶,苦丁茶,凋亡,HepG2人肝癌細(xì)胞

肝癌在我國是發(fā)病率高的惡性疾病,治療困難,患者死亡率高?，F(xiàn)階段對(duì)肝癌的治療缺乏根治的有效手段,多采用早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療來降低患者死亡率。中醫(yī)以提高人體免疫力來達(dá)到預(yù)防和治療癌癥的效果,食品中的有效提取物已經(jīng)被證實(shí)具有一定的抗癌功效,包括茶多酚[1]。飲用茶水來預(yù)防肝癌,針對(duì)肝癌患者也可以通過攝取茶葉中的多酚類物質(zhì)協(xié)助西醫(yī)的手術(shù)和化療等治療手段。

蟲茶是一種特殊的飲品,并不是真正的茶葉,不屬于傳統(tǒng)意義上的茶葉,僅沖泡方式和飲用方式與傳統(tǒng)茶葉相同,同時(shí)蟲茶具有很強(qiáng)的民族特色,產(chǎn)地多在少數(shù)民族聚居的貴州、湖南、廣西、四川和云南等邊遠(yuǎn)地區(qū)[2]。當(dāng)?shù)鼐用癫杉吧目喽〔枞~和化香樹葉等多種野生植物的鮮嫩葉,蒸煮后除去葉片的澀味,將曬干的葉片淋上淘米水后分層堆放在木桶或者竹筐里,葉片輕微自然發(fā)酵后散發(fā)香氣,香氣吸引化香夜蛾等昆蟲在葉片中產(chǎn)卵,孵化出的幼蟲取食葉片后排出的蟲糞顆粒,收集的蟲糞顆粒再經(jīng)暴曬和炒制等工藝得到蟲茶產(chǎn)品[3]。苦丁茶具有多種保健功效,包括預(yù)防癌癥[4]?？喽〔柚械亩喾宇愇镔|(zhì)有多種保健功能[5]。本文對(duì)以苦丁茶為原料制作的蟲茶粗多酚為材料,考察其對(duì)人肝癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用,為開發(fā)蟲茶抗癌功能食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟲茶 為貴州產(chǎn)苦丁茶葉制蟲茶。HepG2人肝癌細(xì)胞 購自于美國典型微生物菌種保藏中心(ATCC)。RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清和MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)、DMSO(二甲亞砜) 美國Sigma公司；CycleTESTTM PLUS DNA染色試劑盒 德國Becton Dickinson公司；Trizol試劑、oligodT18、RNase、dNTP、MLV 美國Invitrogen公司；RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))引物caspase-3、caspase-9、HIAP-1、HIAP-2、p53、p21、E2F1、p73 德國Eppendorf公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

EYELA N-1001S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化器械株式會(huì)社；UV-1750型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；Thermo 3110二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；Combi-514R冷凍離心機(jī) 韓國Hanil株式會(huì)社；Bio-Rad 680酶標(biāo)儀、Bio-Rad小型水平電泳槽 美國Bio-Rad公司；ABI 2720 PCR儀 美國Applied Biosystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)的提取 蟲茶樣品冷凍干燥后打粉。按文獻(xiàn)方法[5],稱取50g打粉后的蟲茶,加入體積比為45%的乙醇溶液50mL,水浴90℃下浸提30min浸提2次,合并2次浸提液后調(diào)節(jié)pH到6,加入80mL混合沉淀劑(10g AlCl3和20g ZnCl2溶于270mL水中)沉淀后在3000r/min下離心分離10min,在沉淀中加入12%鹽酸100mL,分離上清液。在上清液中加入100mL乙酸乙酯萃取后再重復(fù)操作萃取一次,合并兩次萃取液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)提取物。

1.2.2 CPKMI中多酚物質(zhì)的含量測(cè)定 采用酒石酸亞鐵比色法,將綠原酸溶于蒸餾水中制成不同的綠原酸溶液,取1mL綠原酸溶液,加入5mL酒石酸亞鐵溶液,再用pH為7.5的磷酸緩沖液定容到25mL,通過在540nm處測(cè)得的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。CPKMI采用相同的方法測(cè)定多酚含量[6]。

1.2.3 CPKMI對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞生長抑制率測(cè)定 利用MTT法,用含10%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液將HepG2人肝癌細(xì)胞在37℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2～3d更換一次培養(yǎng)液。將癌細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個(gè)/mL后按每孔100μL將細(xì)胞懸液于接種于96孔板中,癌細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24h后,吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,再在孔中加入100μL濃度分別為25、50和100μg/mL的CPKMI的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h,然后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液,加入0.5mg/mL的MTT試劑的培養(yǎng)液混合液100μL再培養(yǎng)4h。最后再次吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液,在孔中加入100μL的DMSO后室溫避光放置30min,然后在540nm處測(cè)定OD值,通過計(jì)算OD值可得到細(xì)胞生長抑制率(%)=[(OD樣品-OD對(duì)照)/ OD對(duì)照]× 100[7]。

1.2.4 RT-PCR法檢測(cè)粗茶多酚對(duì)人肝癌細(xì)胞基因表達(dá)的影響 將人肝癌HepG2細(xì)胞接種于直徑為10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,按細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和樣品處理后用RNAzol試劑提取樣品處理后HepG2細(xì)胞的總RNA。將提取的總RNA濃度調(diào)整至1μg/μL。取2μL的RNA提取液分別加入oligodT18、RNase、dNTP和MLV酶各1μL,5×buffer 10μL,在37℃120min,99℃ 4min,4℃ 3min的條件下合成cDNA。然后以反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增caspase-3、caspase-9、HIAP-1、HIAP-2、p53、p21、E2F1和p73表達(dá),同時(shí)以持家基因作為對(duì)照內(nèi)參照。最后以含濃度溴化乙錠的1%瓊脂電泳檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物[8]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,得到的結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示后使用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)采用one-way ANOVA法分析數(shù)據(jù)結(jié)果在p<0.05水平上是否具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚中的多酚含量

通過酒石酸亞鐵比色法對(duì)CPKMI的多酚含量進(jìn)行測(cè)定,觀察到CPKMI中多酚(綠原酸計(jì))的含量為41.27%,結(jié)合提取前取樣量,可計(jì)算出苦丁茶葉制蟲茶中多酚含量為12.35%,可見本研究中提取方法可以明顯的提高提取物中的多酚含量,提取出的粗多酚物質(zhì)可以用以檢測(cè)其對(duì)癌細(xì)胞的體外凋亡誘導(dǎo)效果。

2.2 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞的體外增殖抑制效果

在體外抗癌實(shí)驗(yàn)中使用MTT法可以觀察待測(cè)樣品對(duì)癌細(xì)胞體外增殖的影響,其結(jié)果可以作為樣品抗癌效果的初步依據(jù)[8]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,CPKMI對(duì)體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞有顯著的抑制作用,CPKMI濃度在25μg/mL下對(duì)癌細(xì)胞的抑制率為17.0%,濃度為50μg/mL時(shí),抑制率為52.5%(p<0.05),濃度為100μg/mL時(shí),抑制率為72.8%(表1)。可見CPKMI對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞的生長抑制呈現(xiàn)量效關(guān)系。

表1 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞的體外增值抑制效果Table1 Growth inhibitory effect of crude polyphenols of Insect tea made by Kuding tea leaves(CPKMI)in HepG2 human hepatoma cells

注:a-d不同字母表示各組數(shù)據(jù)平均值顯著性差異(p<0.05)。

2.3 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚對(duì)HepG2細(xì)胞caspase-3和caspase-9基因表達(dá)的影響

Caspase是一類蛋白酶,參與細(xì)胞的生長和凋亡控制。其中Caspase-9是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的一個(gè)上游的caspase,caspase-3是一個(gè)下游的caspase,它們都是細(xì)胞凋亡效應(yīng)中的效應(yīng)分子[9]。Caspase-9是線粒體通道的細(xì)胞凋亡效應(yīng)分子,被活化后,啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的死亡程序,激活下游的caspase-3將凋亡信號(hào)放大并執(zhí)行,導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,有研究表明,隨著外界功能性物質(zhì)的刺激,體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞的caspase-3和caspase-9表達(dá)強(qiáng)度將上升[10]。本研究表明,CPKMI作用在體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞后,癌細(xì)胞caspase-3和caspase-9的mRNA表達(dá)較未經(jīng)過處理的癌細(xì)胞有明顯上升(圖1),且濃度越大,上升的幅度越大,可見CPKMI可以上調(diào)HepG2肝癌細(xì)胞caspase表達(dá),誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

圖1 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞的caspase-3和caspase-9基因表達(dá)的影響Fig.1 Effect of crude polyphenols of Insect tea made by Kuding tea leaves(CPKMI)on the gene expressions of caspase-3 and caspase-9 in HepG2 human hepatoma cells

2.4 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚對(duì)HepG2細(xì)胞HIAP-1和HIAP-2基因表達(dá)的影響

HIAP-1和HIAP-2均是凋亡抑制基因,能夠抑制caspase酶原達(dá)到減弱誘導(dǎo)凋亡的效果[11]。因此,控制和削弱HIAP-1和HIAP-2在腫瘤細(xì)胞中的影響,有利于激活caspase,充分發(fā)揮誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用[12]。在100μg/mL濃度下較對(duì)照癌細(xì)胞CPKMI可以明顯地抑制和降低HIAP-1和HIAP-2的表達(dá),25μg/mL和50μg/mL濃度的CPKMI也能不同程度的降低HIAP-1和HIAP-2的表達(dá)強(qiáng)度(圖2)。由此可見CPKMI可以控制HepG2癌細(xì)胞中的HIAP-1和HIAP-2基因,從而達(dá)到加強(qiáng)caspase活性的目的,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

圖2 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞的HIAP-1和HIAP-2基因表達(dá)的影響Fig.2 Effect of crude polyphenols of Insect tea made by Kuding tea leaves(CPKMI)on the gene expressions of HIAP-1 and HIAP-2 in HepG2 human hepatoma cells

2.5 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚對(duì)HepG2細(xì)胞p53和p21基因表達(dá)的影響

p53是一種與癌癥關(guān)系最為密切的抗致癌基因,p53基因參與調(diào)控修復(fù)細(xì)胞受損的DNA,細(xì)胞DNA不能修復(fù)時(shí),p53就會(huì)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[13]。p53還通過參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程,起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效果,caspase誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中如果失去p53,誘導(dǎo)凋亡的過程將被大幅度限制[14]。p21基因在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中與p53有一定關(guān)聯(lián),p21同樣能促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[15]。在本實(shí)驗(yàn)中,對(duì)體外培養(yǎng)的HepG2癌細(xì)胞分別采用25、50和100μg/mL濃度的CPKMI進(jìn)行處理,可以看到三個(gè)濃度作用下,癌細(xì)胞中的p53和p21基因表達(dá)均隨著CPKMI濃度升高表達(dá)強(qiáng)度也隨之上調(diào),對(duì)濃度的依賴性呈正相關(guān)(圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明CPKMI可以影響HepG2癌細(xì)胞凋亡,能夠有效的促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)過程。

圖3 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞的p53和p21基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of crude polyphenols of Insect tea made by Kuding tea leaves(CPKMI)on the gene expressions of p53 and p21 in HepG2 human hepatoma cells

2.6 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚對(duì)HepG2細(xì)胞E2F1和p73基因表達(dá)的影響

E2F1能夠特異性誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,高表達(dá)E2F1可以刺激癌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂間期的DNA合成期(S期),然后誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,并且E2F1還可以通過提高p53基因的穩(wěn)定性或刺激p53基因而直接促進(jìn)p53基因的誘導(dǎo)凋亡過程[16]。同時(shí),高表達(dá)的E2F1也可以通過p73基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,p73基因能單獨(dú)的被E2F1激活和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而不需要p53基因的支持[17]。由其他研究的結(jié)果可知,上調(diào)E2F1和p73基因的表達(dá)強(qiáng)度可以更好的誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,100μg/mL的CPKMI刺激HepG2癌細(xì)胞后,細(xì)胞中的E2F1和p73基因表達(dá)強(qiáng)度很強(qiáng)(圖4),即CPKMI也可以通過加強(qiáng)細(xì)胞中的E2F1和p73基因表達(dá)來達(dá)到誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

圖4 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞的E2F1和p73基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of crude polyphenols of Insect tea made by Kuding tea leaves(CPKMI)on the gene expressions of E2F1 and p73 in HepG2 human hepatoma cells

3 結(jié)論

本研究對(duì)苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)的抗肝癌活性進(jìn)行了初步研究。發(fā)現(xiàn)CPKMI對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞有顯著的抑制作用。CPKMI可以上調(diào)caspase-3、caspase-9、p53、p21、E2F1、p73的表達(dá),下調(diào)HIAP-1、HIAP-2的表達(dá)。表明CPKMI可以從多種基因途徑誘導(dǎo)HepG2人肝癌細(xì)胞凋亡。本研究表明,CPKMI有望作為一種抗癌功能性食品的原料,其體內(nèi)的抗癌活性有待進(jìn)一步研究。

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Apoptosis inducing effects of crude polyphenols of Insect tea made by Kuding tea leaves in HepG2 human hepatoma cells

ZHOU Ya-lin,FENG Xia,ZHU Kai,ZHAO Xin*

(Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China)

Tea polyphenols are functional substances present in tea. Insect tea as a traditional drink also contains these compounds,the anticancer effects of these polyphenols need to be scientific researched. In this study,cancer cells apoptosis inducing effects of crude polyphenols of Insect tea made by Kuding tea leaves(CPKMI)were determined. Theinvitrocancer cells growth inhibitory effects of CPKMI were checked by MTT assay,the apoptosis inducing effects of CPKMI were further tested by RT-PCR assay. After 25,50 and 100μg/mL of CPKMI treatment for 48h,cell proliferation of HepG2 human liver cancer cells were inhibited,and the 100μg/mL of CPKMI showed the highest inhibitory rate at 72.8%. CPKMI also significantly induced apoptosis in HepG2 cancer cells(p<0.05)by upregulating caspase-3,caspase-9,p53,p21,E2F1,p73 and down regulating HIAP-1,HIAP-2 mRNA expressions. CPKMI thus present strong cancer cells apoptosis inducing effectsinvitro.

Insect tea;Kuding tea;apoptosis;HepG2 human hepatoma cell

2014-07-24

周雅琳(1976-)，女，博士，副教授，高級(jí)工程師，研究方向：食品科學(xué)。

*通訊作者:趙欣(1981-),男，博士，教授，主要從事食品專業(yè)相關(guān)課程教學(xué)，及食品營養(yǎng)、食品功效和藥食同源產(chǎn)品特性等領(lǐng)域研究工作。

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(KJ1401402)。

TS201.1

A

:1002-0306(2015)09-0339-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.065