劉江濤，龐清江，王 云，吳翠艷，郭 雄

（1．寧波市第二醫(yī)院骨科中心，浙江寧波 315010；2．西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生系、教育部環(huán)境與疾病相關(guān)基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061）

大骨節(jié)?。↘ashin-Beck disease，KBD）是一種地方性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，主要分布在我國從東北至西南的狹長區(qū)域［1］。本病的病因尚不明確，但在過去150年里提出了50余種相關(guān)危險(xiǎn)因素，目前主要集中在三種病因假說：生物地球化學(xué)（低硒）假說，糧食真菌毒素污染中毒假說，以及飲用水有機(jī)質(zhì)污染假說［2］。大骨節(jié)病的特征性病變?yōu)殛P(guān)節(jié)軟骨和生長板軟骨的深層細(xì)胞壞死，軟骨基質(zhì)喪失，進(jìn)而導(dǎo)致繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)病和骨關(guān)節(jié)畸形，嚴(yán)重者可致傷殘和勞動(dòng)能力喪失［3］。成熟軟骨組織中的唯一細(xì)胞類型為軟骨細(xì)胞，它產(chǎn)生并維持軟骨基質(zhì)，且參與軟骨組織損傷的修復(fù)［4］。

線粒體（mitochondrion）在許多細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，包括產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）為細(xì)胞供能，大量中間代謝產(chǎn)物的氧化和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)等。線粒體還是細(xì)胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生的場所，同時(shí)本身也是氧自由基攻擊的靶標(biāo)［5］。線粒體功能障礙可引起細(xì)胞內(nèi)的多種信號級聯(lián)反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及細(xì)胞死亡等［6］。

既往研究表明，大骨節(jié)病患者軟骨細(xì)胞線粒體損傷［7］，且在糧食真菌毒素和環(huán)境低硒等有害可疑致病因素實(shí)驗(yàn)中，軟骨細(xì)胞線粒體損傷的形態(tài)學(xué)改變明顯［8］。由于大骨節(jié)病軟骨損傷主要發(fā)生在兒童和青少年中，隨著年齡的增長而關(guān)節(jié)軟骨損傷加重，是否軟骨線粒體功能損傷與年齡有關(guān)尚不明確。本研究重點(diǎn)評估大骨節(jié)病患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的線粒體功能及其與年齡的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 DMEM購自Hyclone公司，胎牛血清購自蘭州民海公司，Ⅱ型膠原酶購自Gibco公司，TMRM熒光探針、ATP檢測試劑盒和活性氧檢測試劑盒購自GIBCO／Invitrogen公司。

1．2 軟骨組織和細(xì)胞培養(yǎng) 關(guān)節(jié)軟骨組織來自10例大骨節(jié)病患者和8例正常對照。大骨節(jié)病患者是按照大骨節(jié)病診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］被診斷為Ⅱ度和Ⅲ度的患者（4女／6男，43歲至60歲），并在接受全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)時(shí)取其軟骨。正常膝關(guān)節(jié)軟骨取自死于交通意外的捐獻(xiàn)者新鮮尸體（3女／5男，33歲至62歲）。分離軟骨細(xì)胞：PBS沖洗3次，37℃孵育10min。胰蛋白酶處理之后，將軟骨切片置于Ⅱ型膠原酶溶液中37℃孵育12～16h。紗布過濾除去未消化的軟骨碎片，軟骨細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)瓶中，50mL／L CO2培養(yǎng)箱37℃孵育，培養(yǎng)液每周更換2～3次。原代或一代細(xì)胞用于所有實(shí)驗(yàn)。錐蟲藍(lán)染色評估細(xì)胞活力。

1．3 線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性的測定 用分光光度法測定呼吸鏈復(fù)合體活性［9］。將5～40μg的線粒體蛋白加入到終體積為1mL的緩沖液中，分別加入各自的底物后，通過測定340nm波長處還原型煙酰胺腺嘌呤二核 苷 酸 （nicotinamide adenine dinucleotide-reduced，NADH）吸光度值計(jì)算復(fù)合體Ⅰ活性、600nm處二氯酚靛酚（2，6-dichlorophenolindophenol，DCPIP）吸光度值計(jì)算復(fù)合體Ⅱ活性、550nm處還原型細(xì)胞色素C吸光度值計(jì)算復(fù)合體Ⅲ活性，550nm處還原型細(xì)胞色素C吸光度值計(jì)算復(fù)合體Ⅳ活性，以及412nm處5-硫-2-硝基苯甲酸［5，5′-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB］吸光度值計(jì)算檸檬酸合酶的活性。用檸檬酸合酶活性來標(biāo)準(zhǔn)化線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性，酶活性單位為nmol／min／mg protein。

1．4 細(xì)胞內(nèi)ATP含量的檢測 細(xì)胞內(nèi)ATP含量檢測根據(jù)GIBCO／Invitrogen公司的ATP檢測試劑盒說明書操作。離心收集1×106細(xì)胞，TD洗細(xì)胞一次，懸浮于100μL TE緩沖液。先冰上孵育5min；再100℃沸水煮5min。然后14 000g離心2～3min，留取上清到新的EP管；BCA法測定蛋白濃度。雙蒸水稀釋ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻龋?、0．001、0．01、0．1、1、10μmol／L。加樣品和ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液到ATP檢測標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物。利用Biotek Synergy HT多功能微孔板檢測儀檢測化學(xué)發(fā)光，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的ATP含量。

1．5 線粒體膜電位的檢測 離心收集1×106細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞1次，懸浮細(xì)胞于200nmol／L TMRM工作液中，37℃避光孵育15min。PBS洗細(xì)胞3次，重新懸浮細(xì)胞后轉(zhuǎn)移到不透明黑色96孔板，Biotek Synergy HT多功能微孔板檢測儀于540nm激發(fā)波長檢測熒光變化。以Hoechst 33342作為對照，設(shè)定激發(fā)波長392nm，計(jì)算相對線粒體膜電位。

1．6 細(xì)胞內(nèi)活性氧的檢測 收集1×106cells／mL密度的細(xì)胞，以含10μmol／L DCFH-DA的PBS（pH 7．4）取代培養(yǎng)基，37℃避光孵育1h，流式細(xì)胞儀在485nm激發(fā)波長和530nm發(fā)射波長檢測DCFH的熒光強(qiáng)度。結(jié)果以控制熒光強(qiáng)度的百分率表示，熒光強(qiáng)度反映氧化應(yīng)激水平。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，線粒體功能與年齡相關(guān)性研究采用線性回歸分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 正常和大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性的比較 線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性檢測結(jié)果顯示，與正常人軟骨細(xì)胞相比，大骨節(jié)病患者軟骨細(xì)胞線粒體復(fù)合體Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性均顯著下降；相反，檸檬酸合酶活性顯著增加。大骨節(jié)病患者軟骨細(xì)胞線粒體蛋白含量和復(fù)合體Ⅰ活性雖有下降，但與正常對照相比差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2．2 線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性與患者年齡的關(guān)系 線性回歸分析顯示，不論是大骨節(jié)病還是正常對照組，軟骨細(xì)胞復(fù)合體Ⅰ活性和患者年齡之間沒有相關(guān)性；同時(shí)，盡管復(fù)合體Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性在大骨節(jié)病明顯低于正常對照，但是它們和年齡之間也沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性（圖1、表2）。

表1 正常和大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性的比較Tab．1 Specific activity of the mitochondrial respiratory chain complexes in normal and KBD chondrocytes（±s）

表1 正常和大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性的比較Tab．1 Specific activity of the mitochondrial respiratory chain complexes in normal and KBD chondrocytes（±s）

＊ 線粒體呼吸酶鏈復(fù)合體活性用檸檬酸合酶活性校正為：mmol／（min·mg prot）／（檸檬酸合酶活性）×100。

組別 例數(shù) 蛋白量（mg／mL）檸檬酸合酶活性［nmol／（min·mg prot）］線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性［nmol／（min·mg prot）］＊復(fù)合體Ⅰ 復(fù)合體Ⅱ 復(fù)合體Ⅲ 復(fù)合體Ⅳ正常對照 8 2．74±0．49 86．42±15．75 33．67±6．33 12．89±3．22 52．98±6．57 47．20±6．16大骨節(jié)病 10 2．47±0．61 102．26±13．53 29．97±4．79 7．69±2．03 43．90±5．32 38．75±4．81 P值0．33 0．04 0．18 0．001 0．005 0．005

圖1 2組線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性和年齡的關(guān)系Fig．1 Correlation between activity of mitochondrial respiratory chain complexes and donor age in normal and KBD chondrocytes

表2 2組線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性和年齡相關(guān)性的P值Tab．2 P-value of correlation between donor age and activity of mitochondrial respiratory chain complexes （P）

2．3 細(xì)胞內(nèi)ATP含量的分析 大骨節(jié)病患者軟骨細(xì)胞內(nèi)ATP水平（30．68±4．96）比正常軟骨細(xì)胞（42．15±7．27）明顯下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．001）（圖2）。

2．4 軟骨細(xì)胞線粒體膜電位水平 熒光探針TMRM檢測線粒體膜電位結(jié)果顯示，大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞（1．78±0．39）與正常軟骨細(xì)胞（2．72±0．55）相比，線粒體膜電位顯著下降（P＝0．001，圖3）。

圖2 正常對照組和大骨節(jié)病組軟骨細(xì)胞內(nèi)ATP含量的比較Fig．2 Cellular ATP content in normal and KBD chondrocytes

2．5 2組線粒體膜電位和年齡的關(guān)系 雖然細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平隨著年齡的增加而下降，但是回歸分析并未證明二者在大骨節(jié)病患者軟骨細(xì)胞（P＝0．36）或正常軟骨細(xì)胞（P＝0．25）之間存在著關(guān)聯(lián)性（圖4）。

圖3 正常和大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞線粒體膜電位水平的比較Fig．3 Mitochondrial membrane potential in normal and KBD chondrocytes

圖4 軟骨細(xì)胞線粒體膜電位和年齡的相關(guān)性Fig．4 Correlation between mitochondrial membrane potential and donor age

2．6 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的比較 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量反映了線粒體產(chǎn)生和清除氧自由基的功能，過量的活性氧產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。Carboxy-H2DCFDA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧，與正常軟骨細(xì)胞相比，大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量增加了1．2倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．001）（圖5）。

3 討 論

本研究首次證實(shí)了成人大骨節(jié)病患者存在軟骨細(xì)胞線粒體功能的改變，包括線粒體數(shù)目的增多，線粒體呼吸鏈復(fù)合體功能障礙，ATP耗竭，線粒體去極化，以及活性氧含量的增加；線粒體功能與年齡在大骨節(jié)病和正常對照組間均無顯著相關(guān)性。

在氧化磷酸化過程中，線粒體內(nèi)膜上的四個(gè)電子傳遞鏈復(fù)合體（呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ）協(xié)調(diào)作用生成ATP，產(chǎn)生能量。對大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ活性的研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合體Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性明顯降低，與對照組相比分別降低了40．34%、17．14%和17．90%，電子傳遞鏈功能因此受損。而線粒體電子傳遞鏈功能的下降可能通過以下三種途徑得以補(bǔ)償：①通過增加線粒體數(shù)量，檸檬酸合酶活性增加反映了大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞線粒體數(shù)目的增多［10］；②通過復(fù)合體Ⅰ（NADH 脫氫酶）途徑，有氧呼吸中線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ需要較少的氧消耗［11］，而多元回歸分析證實(shí)復(fù)合體Ⅰ活性未見明顯降低；③還可能通過增加無氧代謝避免過多活性氧的產(chǎn)生［12］。呼吸鏈復(fù)合體活性的下降，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP含量的減少。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞內(nèi)ATP含量比對照組減少27．14%。

圖5 正常對照組和大骨節(jié)病組軟骨細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的比較Fig．5 Intracellular ROS level in normal and KBD chondrocytes

細(xì)胞線粒體膜電位的維持與細(xì)胞內(nèi)多種因素有關(guān)。首先，需要線粒體呼吸鏈復(fù)合體功能的正常［13］。研究證實(shí)，利用線粒體呼吸鏈復(fù)合體特異性抑制劑或RNA干擾技術(shù)阻斷呼吸鏈復(fù)合體活性，均可導(dǎo)致線粒體膜電位的降低［14］。其次，細(xì)胞內(nèi)ATP水平對維持線粒體膜電位也非常重要。細(xì)胞內(nèi)ATP和線粒體膜電位相互依存，細(xì)胞利用ATP來維持線粒體膜電位，同時(shí)ATP的產(chǎn)生也需要線粒體提供正常范圍內(nèi)的膜電位［15］。大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞呼吸鏈酶復(fù)合體活性的降低和ATP含量的減少，最終導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位的下降。而較低的線粒體膜電位會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP含量和線粒體呼吸鏈復(fù)合體功能的進(jìn)一步下降，形成一種惡性循環(huán)。

在生物體內(nèi)，氧化和抗氧化處于平衡的狀態(tài)，正常情況下的細(xì)胞代謝需要線粒體消耗氧來滿足機(jī)體的營養(yǎng)和能量需求，進(jìn)行三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝和生成ATP；另一方面線粒體自身富含的多種酶、結(jié)構(gòu)蛋白、膜脂質(zhì)及核酸等，也是活性氧直接攻擊的目標(biāo)［16］。線粒體功能的損傷勢必引起細(xì)胞氧利用率的降低，從而產(chǎn)生更多的ROS，造成線粒體和細(xì)胞內(nèi)氧化損傷的惡性循環(huán)［17］。大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞活性氧含量比正常對照增加1．2倍，同時(shí)線粒體功能明顯受損，說明線粒體功能損傷和氧化應(yīng)激相互作用的不良循環(huán)在大骨節(jié)病的發(fā)病過程中起到重要的作用。

年齡因素被認(rèn)為是與線粒體功能密切相關(guān)的一個(gè)重要指標(biāo)，線粒體功能通常隨著年齡的增加而降低［18］。但在本研究中，我們并未發(fā)現(xiàn)大骨節(jié)病或正常對照者的線粒體功能與年齡相關(guān)。復(fù)合體Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和檸檬酸合酶活性隨年齡的增加而減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相反，復(fù)合體Ⅰ活性隨年齡的增加而升高，同樣它和年齡之間也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平隨著年齡的增加而下降，回歸分析也未能證明二者之間在大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞或正常軟骨細(xì)胞存在關(guān)聯(lián)性。這種結(jié)果可能因?yàn)橐韵聨追矫娴脑颍孩佘浌羌?xì)胞中無氧代謝功能代償性增強(qiáng)，掩蓋了部分線粒體功能隨年齡變化的趨勢。②大骨節(jié)病發(fā)病期主要在兒童，到中老年期病情相對平穩(wěn)，線粒體能也趨于穩(wěn)定［19］。③由于軟骨樣本的特殊性，每個(gè)年齡段的病例數(shù)有限，未能真實(shí)的反映線粒體功能隨年齡變化的趨勢。

總之，線粒體功能障礙參與了大骨節(jié)病的病理生理改變，可能在大骨節(jié)病的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。大骨節(jié)病患者的軟骨細(xì)胞線粒體復(fù)合體Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性、細(xì)胞內(nèi)ATP含量、以及線粒體膜電位的顯著降低。相反，軟骨細(xì)胞線粒體數(shù)目卻明顯增多。這可能是機(jī)體為維持細(xì)胞內(nèi)的ATP產(chǎn)量，代償性升高線粒體量以彌補(bǔ)線粒體氧化磷酸能力的降低。在大骨節(jié)病和正常對照組中，線粒體功能與年齡均無顯著相關(guān)性，說明大骨節(jié)病和軟骨老齡化可能是不同的代謝過程。

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