吳秋平，蔣 力，張?jiān)谟?，閔家新

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院胸外科，重慶 400037)

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炎癥介質(zhì)IL-6及IL-8在撞擊傷肺組織中的表達(dá)研究

吳秋平，蔣 力，張?jiān)谟?，閔家新△

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院胸外科，重慶 400037)

目的 探討炎癥介質(zhì)白細(xì)胞介素(IL)-6及IL-8在聲門緊閉與開放狀態(tài)下閉合性胸部撞擊所致肺損傷組織中的表達(dá)。方法 采用RT-PCR法檢測(cè)聲門緊閉與開放狀態(tài)下，不同時(shí)相點(diǎn)胸部撞擊傷側(cè)與對(duì)照組肺組織IL-6 和IL-8mRNA的表達(dá)。結(jié)果 傷后4、8、12h聲門緊閉組IL-6 和IL-8mRNA的表達(dá)顯著高于聲門開放組(P<0.05)。傷側(cè)肺組織中IL-6 和IL-8mRNA表達(dá)各時(shí)相點(diǎn)顯著高于與對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組、聲門緊閉組和聲門開放組的肺組織兩種細(xì)胞因子IL-8和IL-6mRNA的表達(dá)變化規(guī)律相似，表達(dá)明顯上調(diào)。結(jié)論 提示IL-6和IL-8可能在肺撞擊傷后肺臟功能損害的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。

胸部損傷；撞擊傷；白細(xì)胞介素6；白細(xì)胞介素8

創(chuàng)傷特別是伴有嚴(yán)重胸部創(chuàng)傷的患者，因多發(fā)肋骨骨折和肺挫傷，造成反常呼吸運(yùn)動(dòng)及肺組織出血、水腫，通氣功能、氧彌散功能障礙和肺內(nèi)分流增加。肺是胸部撞擊傷最常累及的人體重要器官，胸部撞擊傷后的肺挫傷、急性肺損傷(acute lung injury，ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)都是常見的致死性器官繼發(fā)性損傷。創(chuàng)傷性ALI主要表現(xiàn)在肺泡毛細(xì)血管膜通透性增高，間質(zhì)水腫，臨床上不一定有特殊癥狀，但隨著病變范圍的擴(kuò)大，可出現(xiàn)進(jìn)行性呼吸困難，頑固性低氧血癥，常在24 h內(nèi)發(fā)展成ARDS[1]。ALI的實(shí)質(zhì)是各種原因引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征在肺部的表現(xiàn)，ARDS即是ALI發(fā)展的嚴(yán)重階段。在病理、生理情況下，機(jī)體多種細(xì)胞大量分泌促炎性細(xì)胞因子并上調(diào)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)分泌，進(jìn)而引發(fā)一系列瀑布樣炎癥反應(yīng)過程，可能是ALI發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一[2]。目前國內(nèi)外一致性認(rèn)為創(chuàng)傷性ALI是一種“炎癥介質(zhì)病”，但真正的發(fā)病機(jī)制仍有待于進(jìn)一步闡明。為此，本研究采用RT-PCR法檢測(cè)傷側(cè)(右肺)肺組織白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6及IL-8mRNA的表達(dá)，為撞擊傷后繼發(fā)性創(chuàng)傷性肺損傷的病因及防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：選取新西蘭實(shí)驗(yàn)兔54只，雌雄不限，體質(zhì)量(2.28±0.35)kg，4月齡。主要試劑：dNTP、TaqDNA聚合酶、RNA酶抑制劑、Oligo(dt)、AMV購自上海生物工程有限公司，總RNA提取試劑盒購自Boehringer Mannheim 公司，PCR Marker購自華美生物工程公司；RT-PCR引物為上海生工公司合成，其引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將54只新西蘭實(shí)驗(yàn)兔，分為對(duì)照組(n=6)、聲門開放組(n=24)和聲門緊閉組(n=24)，聲門開放、緊閉組根據(jù)不同時(shí)間(傷后2、4、8、12 h)又各分為4組(n=6)，觀察傷后2、4、8、12 h IL-6及IL-8 mRNA的變化。撞擊傷模型參照文獻(xiàn)[3]。對(duì)照組：只進(jìn)行麻醉，不致傷；通過開放和夾閉氣管導(dǎo)管模擬聲門開放和緊閉生理狀態(tài)。聲門開放、緊閉組：經(jīng)耳緣靜脈注射1.5%戊巴比妥鈉1 mL/kg麻醉，行氣管插管術(shù)，通過開放和夾閉氣管導(dǎo)管模擬聲門開放和緊閉生理狀態(tài)；將兔固定于兔架上，剪去撞擊點(diǎn)處胸部毛發(fā)；然后將兔架直立，撞擊中心點(diǎn)在兔右鎖骨中線第4肋間，撞擊面積1.77 cm。

表2 各組動(dòng)物右肺組織IL-8 mRNA的表達(dá)比較

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與聲門緊閉組同時(shí)間比較；-：此項(xiàng)無數(shù)據(jù)。

表3 各組動(dòng)物右肺組織IL-6 mRNA的表達(dá)比較

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與聲門緊閉組同時(shí)間比較；-：此項(xiàng)無數(shù)據(jù)。

1.2.2 常規(guī)肺組織總RNA提取 參照Boehringer Mannheim公司說明書。組織RNA 的提取按Trizol 試劑盒說明書進(jìn)行，擴(kuò)增條件：蓋部溫度105 ℃，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性50 s，60 ℃退火58 s(CNTF 56 ℃，CNTFR 56 ℃)，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸8 min，產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)肺組織IL-6及IL-8 mRNA表達(dá) 組織RNA 的提取按Trizol 試劑盒說明書進(jìn)行，擴(kuò)增條件：蓋部溫度105 ℃，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性50 s，60 ℃退火58 s(CNTF 56 ℃，CNTFR 56 ℃)，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸8 min，產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳及圖像分析 配0.5×TBE電泳緩沖液：量取110 mL 5×TBE，加入990 mL(稀釋10倍)三蒸水，定容至1 100 mL；配膠：見試劑配制；配制加樣樣品：樣品及內(nèi)參PCR產(chǎn)物各8 μL，2 mL 6×凝膠加樣緩沖液，充分混勻；加樣：每孔加18 μL樣品，Marker 18 μL；電泳：電壓80 V，電泳時(shí)間1 h；紫外燈下觀察，凝膠圖像掃描。

2 結(jié) 果

2.1 各組動(dòng)物右肺組織IL-8mRNA的表達(dá)比較 傷后不同時(shí)相點(diǎn)撞擊側(cè)(右肺)肺組織中IL-8mRNA有不同的表達(dá)，傷后同一時(shí)相點(diǎn)聲門緊閉、開放組IL-8mRNA值顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。撞擊后，聲門緊閉組和聲門開放組的IL-8mRNA水平逐漸上升，8h時(shí)達(dá)到達(dá)到峰值，后該值逐漸下降。聲門緊閉組IL-8mRNA水平明顯高于聲門開放組(P<0.05)，見表2。

2.2 各組動(dòng)物右肺組織IL-6mRNA的表達(dá)比較 傷后不同時(shí)間在右肺組織中IL-6mRNA有不同的表達(dá)，IL-6mRNA的表達(dá)趨勢(shì)與IL-8mRNA在肺組織中的表達(dá)趨勢(shì)類似。聲門不同狀態(tài)下各組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在傷后IL-6mRNA逐漸上升，在8h時(shí)達(dá)到右肺組織IL-6mRNA達(dá)到峰值。之后該值逐漸下降，到12h時(shí)，各組的IL-6mRNA值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

3 討 論

嚴(yán)重創(chuàng)傷引起機(jī)體神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)，在促炎性細(xì)胞因子作用下，表現(xiàn)為全身性瀑布式炎癥反應(yīng)，發(fā)展到一定程度則演變?yōu)槎嗥鞴俟δ苷系K綜合征(MODS)[3]。肺臟首先遭到損害，表現(xiàn)為持續(xù)的頑固性低氧血癥及呼吸窘迫的臨床特點(diǎn)。Meade等[4]發(fā)現(xiàn)，肺損傷患者的IL-6、IL-8升高，但Donnelly等[5]測(cè)定了嚴(yán)重創(chuàng)傷患者的腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-1、IL-6、IL-8、補(bǔ)體C3a、內(nèi)毒素、心排指數(shù)(cardiacindexCI)。結(jié)果表明，雖然IL-6、IL-8、補(bǔ)體C3a及CI等介質(zhì)和指標(biāo)在ARDS發(fā)生中顯示一定作用，但都不能預(yù)測(cè)ARDS的發(fā)生，即不是ARDS的始動(dòng)因素。說明細(xì)胞因子在創(chuàng)傷性ALI中的作用還有爭議[2]。

本研究對(duì)動(dòng)物受撞擊后肺組織中的幾種細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示IL-6、IL-8mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，提示IL-6、IL-8參與了肺撞擊傷后肺臟功能損害的發(fā)生、發(fā)展過程。IL-6、IL-8主要來源于單核/巨噬細(xì)胞，由于其對(duì)炎癥，特別是急性炎癥有重要的誘導(dǎo)與調(diào)控作用而被稱為前炎癥細(xì)胞因子[6]。IL-6是一種典型的具有廣泛生物學(xué)活性的多功能的單鏈糖蛋白細(xì)胞因子，參加機(jī)體的細(xì)胞免疫、炎癥反應(yīng)及造血調(diào)控等，與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和抗感染防御機(jī)制密切相關(guān)，是一種重要的促炎性因子[7]。IL-8是一種招募中性粒細(xì)胞滲出到炎癥部位的主要趨化因子，中性多核白細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合后，導(dǎo)致細(xì)胞變形、脫顆粒反應(yīng)、呼吸爆發(fā)、釋放溶酶體和過氧化物，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，引起肺組織損傷[8]。

本實(shí)驗(yàn)中，聲門緊閉組和聲門開放組肺組織IL-8、IL-6mRNA水平在傷后8h時(shí)達(dá)到峰值，傷后12h仍有較高表達(dá)。IL-8、IL-6mRNA的表達(dá)規(guī)律相似，說明它們?cè)诜螕p傷后的炎癥反應(yīng)中的作用具有相似性，且IL-8、IL-6mRNA在聲門緊閉組的表達(dá)明顯高于聲門開放組，提示聲門緊閉組的肺損傷程度大于聲門開放組，這一結(jié)果與本研究前期的結(jié)果非常吻合[3]。IL-8、IL-6mRNA在肺組織中的表達(dá)趨勢(shì)十分相似，說明IL-8、IL-6mRNA在功能上具有重疊或相關(guān)性。IL-6、IL-8在撞擊傷組織中的高表達(dá)，是機(jī)體對(duì)創(chuàng)傷的免疫應(yīng)答的一部分，它的表達(dá)水平與撞擊傷傷后局部組織的急性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，正常水平的表達(dá)對(duì)創(chuàng)傷愈合是有利的，而過高往往會(huì)導(dǎo)致諸如炎性滲出過多、過度水腫、壞死加重、膿腫形成等過度炎癥反應(yīng)。前炎癥細(xì)胞因子在創(chuàng)傷后局部的表達(dá)對(duì)機(jī)體組織的影響較在全身血液循環(huán)的表達(dá)重要。

本實(shí)驗(yàn)中無論聲門緊閉與否，撞擊后肺組織IL-6mRNA水平均增高，與Li等[9]報(bào)道的嚴(yán)重創(chuàng)傷患者血清IL-6mRNA水平明顯升高一致，創(chuàng)傷后并發(fā)ARDS患者其血清及支氣管肺泡灌洗液(BAL)中IL-6水平明顯高于非ARDS患者，且與肺功能惡化、血管通透性增高密切相關(guān)。IL-8在撞擊后2h升高，8h后達(dá)到峰值，持續(xù)時(shí)間較久，可能與創(chuàng)傷刺激后，粒細(xì)胞的持續(xù)和過度活化有關(guān)。與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞表面相連的IL-8能增強(qiáng)中性粒細(xì)胞表面的白細(xì)胞整合素(CD11/CD18)的活性，改變其構(gòu)形，掩蓋在白細(xì)胞黏附和滾動(dòng)中起作用的L-選擇素，形成牢固黏附，促使中性粒細(xì)胞跨越內(nèi)皮移行到肺組織[10]，發(fā)生炎癥反應(yīng)，引起肺組織損傷。

撞擊直接損傷可導(dǎo)致肺臟出血和水腫，是物理因素所造成的原發(fā)傷，而內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞變性、細(xì)胞間隙增寬、通透性增強(qiáng)等均應(yīng)視為急性繼發(fā)性肺損傷。盡管繼發(fā)性損傷中有撞擊參數(shù)如驅(qū)動(dòng)壓和壓縮量等物理因素所致，但從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，細(xì)胞因子IL-6和IL-8可能在肺撞擊傷后肺臟功能損害的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。由于與創(chuàng)傷有關(guān)的細(xì)胞因子很多，各細(xì)胞因子之間相互影響、相互作用，呈網(wǎng)絡(luò)樣[11]。因此，關(guān)于細(xì)胞因子IL-6和IL-8在加重肺撞擊傷中的作用和地位，有待進(jìn)一步深入研究[12]。

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Expressions of IL-6 and IL-8 in lung injuries induced by blunt chest trauma

WuQiuping,JiangLi,ZhangZaiyong,MinJiaxin△

(DepartmentofThoracicSurgury,XinqiaoHospitalofThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China)

Objective To study the expression of IL-6 and IL-8 in the lung injuries induced by blunt chest trauma under the closure and open state of glottis.Methods The expressions of IL-6 and IL-8 mRNA were detected by RT-PCR in injuried lung tissues under the closed and open glottis states snd the control lung tissues at designed different time points.Results The expressions of IL-6 and IL-8 mRNA at 4,8,12h in the closed glottis group were obviously higher than those in the open glttis group (P<0.05) and the expressions at designed various time points in the injured lung tissue were higher than those in the control lung tissues (P<0.05).The change rule of IL-6 and IL-8 mRNA expression in the control group,closed glottis group and open glottis group was similar,the expression was up-regulated.Conclusion IL-6 and IL-8 might play an important role in the occurrence and development of functional lesion in the injured lung by blunt chest trauma.

thoracic injuries;impact injury;interleukin-6;interleukin-8

吳秋平(1967-)，副教授，博士研究生，主要從事胸部創(chuàng)傷及胸部腫瘤機(jī)制研究?！?/p>

,Tel:18769986120;E-mail：pk0118@sina.com。

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.007

R

A

1671-8348(2015)10-1317-02

2014-08-30

2014-12-17)