郝鳳奇,李景梅,楊洲紅

(長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130022)

表達(dá)EPEC緊密素蛋白重組嗜酸乳酸桿菌的免疫效果檢測(cè)

郝鳳奇,李景梅,楊洲紅

(長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130022)

【目的】 制備抗腸致病性大腸桿菌(EPEC)的重組嗜酸乳酸桿菌，并初步探索其免疫效果?！痉椒ā?采用DNAStar軟件選取EPEC E2348/69的eae全基因中抗原性較高的984 bp片段(編碼328個(gè)氨基酸殘基，命名為eaeInt328)為目標(biāo)序列，以EPEC E2348/69基因組為模板，PCR擴(kuò)增eaeInt328基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體pSIP409-eae Int328，電轉(zhuǎn)化法獲得相應(yīng)的重組嗜酸乳酸桿菌，采用SppIP誘導(dǎo)重組菌表達(dá)，并通過SDS-PAGE和Western-blot鑒定重組蛋白。以BALB/c雌性小鼠為受試動(dòng)物，灌胃重組嗜酸乳酸桿菌15 d后，再灌胃EPEC，第21天，取結(jié)腸PP結(jié)和腸內(nèi)容物，15和21 d稱體質(zhì)量，同時(shí)設(shè)PBS(對(duì)照)、EPEC和pSIP409空載體轉(zhuǎn)化嗜酸乳酸桿菌處理。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)腸PP結(jié)中的CD11c+DC、CD4+T、CD19+B細(xì)胞比例，采用ELISA檢測(cè)腸內(nèi)容物中的特異性sIgA水平?！窘Y(jié)果】 克隆得到了984 bp的eaeInt328基因，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSIP409-eae Int328，制備了相應(yīng)的重組嗜酸乳酸桿菌，用SppIP誘導(dǎo)表達(dá)后，重組嗜酸乳酸桿菌表達(dá)了分子質(zhì)量約為36 ku的重組蛋白，該重組蛋白與eae單克隆抗體可發(fā)生特異性結(jié)合。與EPEC和pSIP409空載體轉(zhuǎn)化嗜酸乳酸桿菌組相比，21 d時(shí)，pSIP409重組嗜酸乳酸桿菌組小鼠體質(zhì)量顯著增加，且與PBS組小鼠無顯著差異。該重組嗜酸乳酸桿菌可顯著提高BALB/c小鼠結(jié)腸PP結(jié)中的CD19+B細(xì)胞比例，極顯著提高結(jié)腸PP結(jié)中的CD11c+DC和CD4+T細(xì)胞比例，使腸道黏膜產(chǎn)生針對(duì)EPEC的特異性sIgA?！窘Y(jié)論】 pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌通過CD11c+DC的介導(dǎo)，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞數(shù)量增加，進(jìn)而誘導(dǎo)B細(xì)胞活化產(chǎn)生針對(duì)EPEC的特異性sIgA，進(jìn)而對(duì)小鼠EPEC的急性感染發(fā)揮作用。

腸致病性大腸桿菌；eae基因；重組嗜酸乳酸桿菌

腸致病性大腸桿菌(EnteropathogenicEscherichiacoli,EPEC)是引起5歲以下兒童細(xì)菌性腹瀉暴發(fā)和散發(fā)的重要病原微生物，每年可導(dǎo)致數(shù)以千計(jì)的嬰幼兒死亡[1]，也是引起幼齡動(dòng)物細(xì)菌性腹瀉的重要原因。EPEC 的主要致病機(jī)制是粘附與脫落(A/E)[2]，主要由eae基因編碼的緊密素所引起，eae基因突變菌株則失去緊密粘附于上皮細(xì)胞的能力，不能產(chǎn)生A/E損傷[3]。此外，緊密素也是良好的候選抗原，可用于EPEC疫苗的研制[4]。

乳酸桿菌是人和動(dòng)物消化道內(nèi)的共生菌，可作為腸道功能性蛋白遞送的活載體。近年來，表達(dá)功能性蛋白重組乳酸桿菌的研究方興未艾，如表達(dá)彈性蛋白酶抑制劑(Elafin)用于改善腸道炎癥、表達(dá)超氧化物歧化酶(SOD)用于清除氧自由基、表達(dá)白細(xì)胞介素10(IL-10)等細(xì)胞因子用于調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫及表達(dá)抗原蛋白用于產(chǎn)生特異性保護(hù)抗體[5]等。筆者的前期研究證實(shí)，嗜酸乳酸桿菌具有黏膜免疫調(diào)節(jié)作用[6]，本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，采用重組DNA技術(shù)構(gòu)建了攜帶EPEC E2348/69部分eae基因的乳酸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒pSIP409-eae Int328，制備了相應(yīng)的重組嗜酸乳酸桿菌，并通過小鼠體內(nèi)試驗(yàn)，初步探索了該重組基因工程菌的免疫效果，旨在為深入研究抗EPEC的重組乳酸桿菌微生態(tài)制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 嗜酸乳酸桿菌、大腸桿菌(E.coli)DH5α、腸致病性大腸桿菌E2348/69由長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 質(zhì)粒載體 pMD18T克隆質(zhì)粒載體，購自寶生物工程(大連)有限公司；大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體pSIP409、SppIP誘導(dǎo)肽由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)王春鳳教授惠贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基，購自Gibco公司；Anti-mouseCD11c-FITC、Anti-mouseCD4-PE、Anti-mouseCD19-APC單克隆抗體和FACS Buffer，購自BD公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG、IgA，購自美國(guó)Santa Cruz公司；ExTaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、NcoⅠ、Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶和dNTP mix，購自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；EDTA，購自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；絲氨酸蛋白酶抑制劑，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c雌性小鼠，40只，體質(zhì)量18～22 g/只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 EPECeaeInt328基因的選擇及引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank登錄的EPEC E2348/69毒力島基因座(GenBank登錄號(hào)：AF022236.1)中eae基因的序列，采用DNAStar軟件分析其抗原指數(shù)，確定其開放閱讀框中24 921至25 904 位間長(zhǎng)度為984 bp的片段為目標(biāo)序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)上、下游引物，并引入NcoⅠ、Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)和TAA終止密碼子。引物序列為：上游引物(F)5′-CCATGGCTGGTTTAGGATTGTT-3′，下劃線部分為NcoⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物(R) 5′-GGAAGCTTTTACTGCTCATACATCA-3′，下劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。

1.2.2 EPECeaeInt328基因的克隆 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按照說明書操作提取EPEC E2348/69基因組。PCR反應(yīng)體系50 μL：10×ExTaqBuffer 5.0 μL，dNTP mix 4.0 μL，上下游引物各1.0 μL，EPEC E2348/69基因組模板0.5 μL，ExTaq酶0.5 μL，雙蒸水38.0 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，采用DNA凝膠純化試劑盒回收，與pMD18T質(zhì)粒載體連接，獲得pMD18T-eae Int328，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)DH5α，經(jīng)含100 μg/mL氨芐青霉素(AMP)的LB平板篩選，挑取2個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切檢測(cè)，并送至生工生物(上海)工程有限公司測(cè)序。

1.2.3 pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌的制備 將pSIP409和pMD18T-eae Int328分別進(jìn)行NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，回收目的片段后用T4 DNA酶進(jìn)行連接，獲得pSIP409-eae Int328，將其電轉(zhuǎn)化至嗜酸乳酸桿菌[7]，經(jīng)含200 μg/mL紅霉素(EM)的LB平板篩選，挑取2個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行NcoⅠ 和Hind Ⅲ雙酶切檢測(cè)。

1.2.4 pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá) 將雙酶切鑒定正確的pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到100 mL MRS培養(yǎng)基中，其中菌液與培養(yǎng)基的體積比為1∶50，37 ℃厭氧培養(yǎng)至菌液OD600為0.6時(shí)，加入終質(zhì)量濃度為50 ng/mL的SppIP誘導(dǎo)肽，誘導(dǎo)表達(dá)4 h后，產(chǎn)物于4 ℃下12 000 r/min離心，收集菌體，菌體用PBS洗滌2次，加40 μL 1×上樣緩沖液和10 μL DTT，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，以轉(zhuǎn)化pSIP409的嗜酸乳酸桿菌為對(duì)照。同時(shí)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)Western-blot檢測(cè)，簡(jiǎn)言之，將轉(zhuǎn)印好表達(dá)產(chǎn)物的硝酸纖維素膜置于含30 g/L BSA PBS的平皿中，室溫下振蕩封閉2 h，棄去封閉液，加入鼠源eae單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清(體積比1∶100稀釋)，室溫下孵育2 h，用PBS清洗3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(體積比1∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h，用PBS清洗3次，加入DAB顯色液于室溫下緩慢振蕩。

1.2.5 菌液制備 將pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌、pSIP409嗜酸乳酸桿菌，分別采用MRS培養(yǎng)基于37 ℃厭氧培養(yǎng)至菌液OD600為0.6～0.8時(shí)，4 ℃、6 000 r/min離心2 min，菌體沉淀用1×PBS(pH7.4)清洗3次后，配制成108CFU/mL的菌體懸液。EPEC(E2348/69)采用LB培養(yǎng)基，于37 ℃下，150 r/min搖床培養(yǎng)，配制成108CFU/mL的菌體懸液。

1.2.6 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 試驗(yàn)小鼠平均分成4組(PBS組、EPEC組、pSIP409嗜酸乳酸桿菌組和pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌組)，清潔級(jí)飼養(yǎng)，自由飲水和采食，12 h光照，12 h黑暗，試驗(yàn)期21 d。試驗(yàn)期內(nèi)，pSIP409嗜酸乳酸桿菌組和pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌組小鼠分別灌胃相應(yīng)菌體懸液1 mL/(只·d)，PBS組和EPEC組灌胃等體積的PBS。第15天，除PBS組外，其余3組灌胃EPEC菌體懸液1 mL/(只·d)。第21天，頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，取結(jié)腸PP結(jié)和腸內(nèi)容物備檢。試驗(yàn)15和21 d清晨飼喂前稱體質(zhì)量。

1.2.7 結(jié)腸PP結(jié)細(xì)胞懸液的制備 將結(jié)腸PP結(jié)置于盛放有RPMI 1640培養(yǎng)基的平皿中，注射器末端研磨后，過無菌篩網(wǎng)制成細(xì)胞懸液，4 ℃下2 000 r/min離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用1×PBS洗滌2次，加入適量RPMI 1640培養(yǎng)基計(jì)數(shù)。

1.2.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 取1.2.7制備的細(xì)胞懸液200 μL，加入2.0 mL FACS Buffer，1 500 r/min離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用1×PBS洗滌2次。細(xì)胞用FACS Buffer混勻，加入到Tube管中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為106/管，每管加入10 μL熒光標(biāo)記抗體，CD11c+樹突細(xì)胞(CD11c+DC)、CD4+T細(xì)胞(CD4+T)、CD19+B細(xì)胞(CD19+B)比例檢測(cè)分別采用Anti-mouseCD11c-FITC、Anti-mouseCD4-PE、Anti-mouseCD19-APC單克隆抗體，4 ℃避光作用30 min，F(xiàn)ACS Buffer洗滌2次，最后溶于100 μL FACS Buffer 中，加入10 μL多聚甲醛固定，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.9 腸道中特異性分泌型IgA(sIgA)的檢測(cè) 小鼠腸內(nèi)容物按每100 mg加入500 μL PBS(pH7.0)，制成勻漿，4 ℃靜置20 min，加入終濃度為 0.05 mol/L EDTA和1 mmol/L 絲氨酸蛋白酶抑制劑，于4 ℃下10 000 r/min離心40 min，取上清液備用，用ELISA法檢測(cè)特異性sIgA水平，簡(jiǎn)言之，EPEC過夜培養(yǎng)物經(jīng)超聲破碎，用包被液1∶20倍稀釋后取100 μL包被酶標(biāo)板(于4 ℃下包被過夜)，次日洗滌后用100 g/L的BSA 封閉，每孔加入體積比1∶5稀釋的腸內(nèi)容物100 μL，于37 ℃下孵育3 h，以PBS作空白對(duì)照，洗滌后每孔加入 HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgA(體積比1∶5 000稀釋)100 μL，于37 ℃下孵育1.5 h，洗滌后每孔加入顯色底物溶液100 μL，室溫避光顯色10 min，每孔加50 μL終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)讀取吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Graphpad Prism 6.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPEC eae Int328基因的克隆

由圖1可知，以EPEC E2348/69基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到了eaeInt328基因片段，該片段含編碼序列、上下游酶切位點(diǎn)、保護(hù)性堿基和終止密碼子共1 000 bp，其中編碼序列984 bp。由圖2可知，NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切重組克隆質(zhì)粒pMD18T-eae Int328獲得了與理論值相符的載體基因片段和eaeInt328基因片段。測(cè)序結(jié)果表明，克隆的eaeInt328基因序列與GenBank登錄的模板序列(GenBank登錄號(hào)：AF022236.1)相似性為100%。

2.2 pSIP409-eae Int328重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

由圖3可知，NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切重組表達(dá)質(zhì)粒載體pSIP409-eae Int328，獲得了與理論值相符的載體基因片段和eaeInt328基因片段。

2.3 重組嗜酸乳酸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)

由圖4可知，與pSIP409轉(zhuǎn)化的嗜酸乳酸桿菌相比，pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌表達(dá)了分子質(zhì)量約為36 ku的重組蛋白。由圖5可知，該重組蛋白能夠與eae單克隆抗體特異性結(jié)合。

2.4 重組嗜酸乳酸桿菌對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

試驗(yàn)第15和21天，分別稱量小鼠體質(zhì)量，結(jié)果如表1所示。由表1可見，試驗(yàn)15 d，各組小鼠體質(zhì)量無顯著差異(P>0.05)；試驗(yàn)21 d，與PBS組相比，EPEC組和pSIP409轉(zhuǎn)化的嗜酸乳酸桿菌組小鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)；與EPEC組和pSIP409轉(zhuǎn)化的嗜酸乳酸桿菌組相比，pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌組小鼠體質(zhì)量顯著增加(P<0.05)，并且與PBS組相比無顯著差異(P>0.05)。

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Same lowercase letters in each column indicate insignificant difference (P>0.05),different letters indicate significant difference (P<0.05).

2.5 重組嗜酸乳酸桿菌對(duì)小鼠結(jié)腸PP結(jié)中CD11c+ DC比例的影響

重組嗜酸乳酸桿菌對(duì)小鼠結(jié)腸PP結(jié)中CD11c+DC比例的影響見圖6。由圖6可知，PBS組、EPEC組、pSIP409嗜酸乳酸桿菌組、pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌組小鼠結(jié)腸PP結(jié)中CD11c+DC細(xì)胞比例分別為(33.18±0.63)%，(36.30±0.83)%，(39.09±0.57)%和(39.39±0.52)%。與PBS相比，EPEC顯著提高了CD11c+DC細(xì)胞比例(P<0.05)，而pSIP409嗜酸乳酸桿菌和pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌均極顯著提高了CD11c+DC細(xì)胞比例(P<0.01)。與EPEC相比，pSIP409嗜酸乳酸桿菌和pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌均顯著提高了CD11c+DC細(xì)胞比例(P<0.05)。

2.6 重組嗜酸乳酸桿菌對(duì)小鼠結(jié)腸PP結(jié)中CD4+ T細(xì)胞比例的影響

由圖7可知，PBS組、EPEC組、pSIP409嗜酸乳酸桿菌組、pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌組小鼠結(jié)腸PP結(jié)中CD4+T細(xì)胞比例分別為(34.68±1.29)%，(34.74±1.69)%，(42.60±1.30)%和(42.61±0.92)%。與PBS和EPEC相比，pSIP409嗜酸乳酸桿菌和pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌均極顯著提高了CD4+T細(xì)胞比例(P<0.01)。

2.7 重組嗜酸乳酸桿菌對(duì)小鼠結(jié)腸PP結(jié)中CD19+ B細(xì)胞比例的影響

由圖8所知，PBS組、EPEC組、pSIP409嗜酸乳酸桿菌組、pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌組小鼠結(jié)腸PP結(jié)中CD19+B細(xì)胞比例分別為(21.95±1.23)%，(22.05±1.35)%，(21.40±0.36)%，(26.77±1.00)%。與PBS、EPEC和pSIP409嗜酸乳酸桿菌相比，pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌顯著提高了CD19+B細(xì)胞比例(P<0.05)。

2.8 重組嗜酸乳酸桿菌對(duì)腸道中特異性sIgA水平的影響

由圖9所知，EPEC組、pSIP409嗜酸乳酸桿菌組、pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌組小鼠腸道內(nèi)容物中特異性sIgA的吸光度值分別為0.53±0.04，0.54±0.06，1.34±0.04,與PBS相比，均極顯著增加了特異性sIgA的水平。與EPEC和pSIP490嗜酸乳酸桿菌相比，pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌極顯著增加了特異性sIgA的水平(P<0.01)。

圖6 pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌對(duì)小鼠結(jié)腸PP結(jié)中CD11c+DC細(xì)胞比例的影響柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05), 標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同
Fig.6 Ratio of CD11c+DC in colon PP influenced by pSIP409-eae Int328 recombinantLactobacillusacidophilusDifferent lowercase letters indicate significant difference (P<0.05),different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01).The same below

圖7 pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌對(duì)小鼠結(jié)腸PP結(jié)中CD4+T細(xì)胞比例的影響
Fig.7 Ratio of CD4+T in colon PP influenced by pSIP409-eae Int328 recombinantLactobacillusacidophilus

圖9 pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌對(duì)小鼠腸道中特異性sIgA水平的影響
Fig.9 Intestinal specific sIgA titers influenced by pSIP409-eae Int328 recombinantLactobacillusacidophilus

3 討 論

eae基因位于LEE 致病島，核苷酸序列分析表明，EPEC E2384/69 的eae基因含有長(zhǎng)2 817 bp的開放閱讀框，編碼一個(gè)含939個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)分子，稱之為緊密素蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量102.4 ku[8]。含eae基因的EPEC能夠引起腸黏膜出現(xiàn)典型的A/E損傷病變[9]。研究表明，EPEC感染后能夠在體內(nèi)檢測(cè)到抗緊密素蛋白抗體，緊密素免疫反應(yīng)能夠抵抗緊密素蛋白陽性EPEC的感染，說明緊密素是一種保護(hù)性抗原[4]。然而，eae全基因較大，不適合作為重組抗原的候選基因。本試驗(yàn)采用DNAStar軟件，分析了eae全基因的抗原性指數(shù)(Jameson-Wolf法)，結(jié)合表達(dá)載體pSIP409的酶切位點(diǎn)，選擇了編碼328個(gè)氨基酸殘基的核苷酸序列(984 bp)作為靶基因，構(gòu)建了乳酸菌重組表達(dá)載體pSIP409-eae Int328。

結(jié)腸PP結(jié)是分布在結(jié)腸組織中的次級(jí)淋巴器官，富含樹突細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞(Mφ)及T、B細(xì)胞，是結(jié)腸組織發(fā)揮局部黏膜免疫應(yīng)答的主要場(chǎng)所[10]。

DC是重要的抗原遞呈細(xì)胞，在介導(dǎo)先天免疫和獲得性免疫中具有重要作用，CD11c+DC是小鼠成熟的DC(mDC)，具有典型的抗原遞呈功能，通過給予Na?ve T細(xì)胞TCR和共刺激分子信號(hào)誘導(dǎo)其分化為效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞[11]。乳酸桿菌能夠通過其表面微生物相關(guān)分子識(shí)別模式(如肽聚糖、磷壁酸、S-層蛋白等)與DCs表面模式識(shí)別受體(如TLR、CLR等)相結(jié)合，引發(fā)下游免疫級(jí)聯(lián)信號(hào)，調(diào)控DC功能[12]。本試驗(yàn)中pSIP409嗜酸乳酸桿菌和pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌均極顯著提高了結(jié)腸PP結(jié)中CD11c+DC比例，而這2組間無顯著差異，表明嗜酸乳酸桿菌能夠增強(qiáng)DC的抗原遞呈功能。盡管EPEC單獨(dú)灌胃也顯著提高了結(jié)腸PP結(jié)中CD11c+DC比例，但是顯著低于pSIP409嗜酸乳酸桿菌和pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌，表明DC在病原微生物感染的狀態(tài)下也趨近成熟。

CD4+T細(xì)胞是輔助性T細(xì)胞亞群，是廣泛存在于機(jī)體的效應(yīng)性T細(xì)胞，在介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫方面發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)中，pSIP409嗜酸乳酸桿菌和pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌均極顯著提高了結(jié)腸PP結(jié)中CD4+T細(xì)胞比例，而這2組間無顯著差異，結(jié)合對(duì)CD11c+DC比例的影響結(jié)果，推測(cè)嗜酸乳酸桿菌可能通過CD11c+DC的介導(dǎo)，促進(jìn)了CD4+T細(xì)胞的數(shù)量增加，尤其是pSIP409-eae Int328重組嗜酸乳酸桿菌進(jìn)一步通過該途徑活化了B細(xì)胞，產(chǎn)生了針對(duì)EPEC的特異性sIgA。

乳酸桿菌作為人和動(dòng)物消化道中的益生菌，具有幫助消化、調(diào)節(jié)免疫的特性。本課題組前期的研究表明，嗜酸乳酸桿菌能夠顯著上調(diào)Th1和Th2型免疫反應(yīng)，顯著提高腸道黏膜sIgA水平[6]。本試驗(yàn)在該嗜酸乳酸桿菌本身的免疫調(diào)節(jié)功能基礎(chǔ)上，采用重組DNA技術(shù)制備了表達(dá)EPEC緊密素抗原蛋白的重組嗜酸乳酸桿菌，經(jīng)小鼠體內(nèi)研究證實(shí)，該重組嗜酸乳酸桿菌對(duì)EPEC的感染具有一定的保護(hù)作用，為深入開發(fā)抗EPEC的重組乳酸桿菌微生態(tài)制劑提供了有價(jià)值的參考。然而，本試驗(yàn)只檢測(cè)了重組嗜酸乳酸桿菌對(duì)PP結(jié)中DC的活化功能，鑒于PP結(jié)中M細(xì)胞和Mφ在抗原遞呈和免疫調(diào)控方面也具有一定作用[13-14]，因此對(duì)于嗜酸乳酸桿菌或重組嗜酸乳酸桿菌是否增強(qiáng)了這2類細(xì)胞的功能，值得進(jìn)一步探討。

[1] Kaper J B,Nataro J P,Mobley H L.PathogenicEscherichiacoli[J].Nature Reviews Microbiology,2004,2(2):123-140.

[2] Chen H D,Frankel G.EnteropathogenicEscherichiacoli:Unravelling pathogenesis [J].Fems Microbiology Reviews,2005,29(1):83-98.

[3] Donnenberg M S,Tzipori S,McKee M L,et al.The role of the eae gene of enterohemorrhagicEscherichiacoliin intimate attachmentinvitroand in a porcine mode [J].Journal of Clinical Investigation,1993,92(3):1418-1424.

[4] 陳 萍,劉景圣,馮書章.eae基因及其編碼的緊密素研究進(jìn)展 [J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2007,23(5):515-517.

Chen P,Liu J S,Feng S Z.Progress ofeaegene and intimin [J].Chinese Journal of Zoonoses,2007,23(5):515-517.(in Chinese)

[5] Bermúdez-Humarán L G,Aubry C,Motta J P,et al.Engineering lactococci and lactobacilli for human health [J].Current Opinion in Microbiology,2013,16(3):278-283.

[6] 郝鳳奇,李景梅,李成玉,等.2種乳酸桿菌腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)作用的比較 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2014,42(10):29-34.

Hao F Q,Li J M,Li C Y,et al.Comparison of the intestinal mucosal immuneregulation functions of twoLactobacillusstrains [J].Journal of Northwest A&F University:Natural Science Edition,2014,42(10):29-34.(in Chinese)[7] 郝鳳奇,李景梅,楊桂連.乳酸菌Nisin誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 [J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012(8):624-628.

Hao F Q,Li J M,Yang G L.Construction and application of Nisin-controlled expressionplasmid forLactococcusacidophilus[J].Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine,2012(8):624-628.(in Chinese)

[8] Frankel G,Candy D C,Everest P,et al.Characterization of the C-terminal domains of intimin-like proteins of enteropathogenic and enterohemorrhagicEscherichiacoli,Citrobacterfreundii,andHafniaalvei[J].Infection and Immunity,1994,62(5):1835-1842.

[9] 孫 暉,趙愛蘭,白向?qū)?等.不同來源腸致病性大腸桿菌(EPEC)分離株eae基因分析 [J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2014,21(7):773-776.

Sun H,Zhao A L,Bai X N,et al.Typing of intimin (eae) genes from enteropathogenicEscherichiacolistrains isolated from human beings and different animal species [J].Practical Preventive Medicine,2014,21(7):773-776.(in Chinese)

[10] Murphy,Kenneth.Immunobiology [M].7th ed.New York,America:Garland Science,Taylor & Francis Group,2008:462-464.

[11] Shortman K,Liu Y J.Mouse and human dendritic cell subtypes [J].Nature Reviews Immunology,2002,2(3):151-161.

[12] van Baarlen P,Wells J M,Kleerebezem M.Regulation of intestinal homeostasis and immunity with probiotic lactobacilli [J].Trends in Immunology,2013,34(5):208-215.

[13] Craig L M,Charles O E,Robin D H,et al.Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system [J].Nature,2012,489:231-241.

[14] Richman L K,Graeff A S,Strober W.Antigen presentation by macrophage-enriched cells from the mouse Peyer’s patch [J].Cellular Immunology,1981,62(1):110-118.

Detecting immune efficacy of recombinantLactobacillusacidophilusexpressing enteropathogenicEscherichiacoli

HAO Feng-qi,LI Jing-mei,YANG Zhou-hong

(SchoolofLifeScience&Technology,ChangchunUniversityofScience&Technology,Changchun,Jilin130022,China)

【Objective】 This study prepared anti-EPEC recombinantLactobacillusacidophilusand determined its immune efficacy.【Method】 DNAStar software was used to select the 984 bp fragment (encoding 328 aa) with high antigen index from EPEC E2348/69.eaeInt328 gene was amplified by PCR using genome DNA of EPEC E2348/69 as template,and was inserted into plasmid pSIP409 to construct plasmid pSIP409-eae Int328.Then recombinantLactobacillusacidophiluswas obtained using electro-transformation.The recombinant protein was expressed with induction of SppIP,and identified by SDS-PAGE and Western-blot.Fifteen days after intragastric administration of pSIP409-eae Int328 recombinantLactobacillusacidophilus,EPEC was also administrated to BALB/c mice.On the 21st day,mice were killed,and CD11c+DC,CD4+T cell,and CD19+B cells in colon Peyer’s patch and specific sIgA level in intestine were detected using Flow cytometry and ELISA,respectively.【Result】 TheeaeInt328 gene with length of 984 bp was amplified,and the recombinant plasmid pSIP409-eae Int328 was constructed successfully.The pSIP409-eae Int328 recombinantLactobacillusacidophiluswas successfully prepared and the recombinant protein with 36 ku was expressed after SppIP induction and its capacity of specific binding to eae monoclonal antibody was confirmed.The pSIP409-eae Int328 recombinantLactobacillusacidophilusincreased the ratios of CD11c+DC,CD4+T cell,and CD19+B cell in colon Peyer’ patch.The specific sIgA against EPEC in intestine was produced by stimulation of pSIP409-eae Int328 recombinantLactobacillusacidophilus.【Conclusion】 The pSIP409-eae Int328 recombinantLactobacillusacidophiluspromoted CD4+T cell expansion through the mediation of CD11c+DC,and further induced activation of B cell to produce sIgA against EPEC,which prevented mice from EPEC acute infection.

EPEC;eaegene;recombinantLactobacillusacidophilus

2015-03-12

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20090246，201101004)

郝鳳奇(1981-)，男，吉林長(zhǎng)春人，講師，碩士，主要從事微生物與免疫學(xué)研究。E-mail:hao4269@126.com

李景梅(1969-)，女，吉林長(zhǎng)春人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事微生物學(xué)研究。E-mail:ljm3023@126.com

時(shí)間:2015-05-11 15:02

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.003

Q939.91

A

1671-9387(2015)06-0028-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1502.003.html