張響玲，羅建讓，張延龍，牛立新，孫道陽，梁振旭

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

岷江百合中黃瓜花葉病毒誘導(dǎo)LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及表達

張響玲，羅建讓，張延龍，牛立新，孫道陽，梁振旭

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 探索岷江百合(Liliumregale)的抗病毒病機制，為開展百合抗病毒育種工作奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?對岷江百合葉片接種黃瓜花葉病毒(CMV)，采用RACE技術(shù)克隆岷江百合NAC轉(zhuǎn)錄因子基因(LrNAC)，對其全長cDNA序列進行生物信息學(xué)分析；利用實時熒光定量PCR對LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的器官特異性及CMV侵染后該基因的表達模式進行分析?！窘Y(jié)果】LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因全長827 bp，可編碼由208個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，該蛋白具有NAC家族保守結(jié)構(gòu)域；該蛋白為堿性、親水性、非分泌、不具跨膜區(qū)蛋白；分子質(zhì)量為23.4 ku，等電點為9.48。LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因在岷江百合嫩葉中相對表達量最高，在嫩莖中最低；該基因可以被CMV誘導(dǎo)上調(diào)表達，CMV處理后岷江百合、卷丹(L.lancifolium)和宜昌百合(L.leucanthum)中，LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的相對表達量分別在處理后4 d、3 d和4 d達到最大值，分別為處理前的38倍、3倍和13倍?！窘Y(jié)論】LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因在岷江百合抗黃瓜花葉病毒防御反應(yīng)過程中發(fā)揮作用。

岷江百合；黃瓜花葉病毒；LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因；RACE；基因表達

百合是一種集觀賞、食用、藥用于一體的名貴花卉，而病毒病卻是制約百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要瓶頸，其中黃瓜花葉病毒(CMV)是國內(nèi)外報道的能夠侵染百合的20種病毒中危害范圍最為廣泛的病毒之一[1]。國內(nèi)外學(xué)者在百合病毒病的防治過程中進行了各方面的研究，主要包括傳統(tǒng)毒源清除和隔離、抗病毒品種培育、脫毒及病毒傳播介體的防治等。王進忠等[2]將商陸抗病毒蛋白基因轉(zhuǎn)入麝香百合中，使百合植株產(chǎn)生抗病毒特性。Pejman等[3]將黃瓜花葉病毒復(fù)制酶缺陷基因(CMV2-GDD)用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入栽培百合Acapulco品種中，獲得2個抗CMV的株系。

岷江百合是一種抗病性極強的百合優(yōu)異種質(zhì)資源,對病毒具有很高的抗性[4-5]。王仙芝等[6]對百合病毒病研究發(fā)現(xiàn)，岷江百合對CMV、百合斑駁病毒(LSV)、百合無癥病毒(LMoV)的抗病程度可以達到免疫。蚜蟲(病毒傳播媒介)接種試驗表明，岷江百合對蚜蟲的抗性極弱；CMV 和LMoV復(fù)合接種試驗結(jié)果顯示，接種初期岷江百合易被病毒侵染，但后期其體內(nèi)病毒增長量很小[7]。由此可以推測，岷江百合可能通過特殊的生化抗病毒機制來增強自身的抗病毒能力。因此，探索岷江百合抗病毒病的特殊機制對于更好地利用這一優(yōu)質(zhì)的抗病毒種質(zhì)資源具有重要意義。

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[8-9]，自1996年從矮牽牛中克隆到第一個NAC轉(zhuǎn)錄因子基因以來[10]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在多種植物的基因組中都有超過100個該家族基因存在[11-14]。NAC轉(zhuǎn)錄因子不僅在植物的生長發(fā)育、模式建成、細(xì)胞程序性死亡等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[15-20]，而且還參與了植物的抗病原菌(包括病毒、細(xì)菌、真菌)和抗非生物脅迫反應(yīng)[21]。其中，在抗病毒方面的研究表明，辣椒CaNAC1轉(zhuǎn)錄因子基因在辣椒輕斑駁病毒(PMMV)侵染后能夠被快速誘導(dǎo)[22]。NAC轉(zhuǎn)錄因子可以通過參與病毒復(fù)制過程或與病毒蛋白因子互作從而在抗病毒過程中發(fā)揮作用[21]。水稻RIM1作為與矮縮病毒(RDV)復(fù)制有關(guān)的因子能夠控制水稻對RDV的感病性[23]。擬南芥中的NAC 轉(zhuǎn)錄因子TIP蛋白可以與蕪菁皺縮病毒(TCV)的外殼蛋白結(jié)合,兩者互作能夠促使擬南芥產(chǎn)生過敏反應(yīng)從而提高對TCV的抗性[24]。鑒于NAC轉(zhuǎn)錄因子在多種植物抗病毒中發(fā)揮的重要作用，本研究根據(jù)CMV誘導(dǎo)的岷江百合cDNA文庫中的LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的EST序列設(shè)計特異引物，采用RACE技術(shù)克隆LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的全長cDNA，并利用實時定量PCR分析LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因在岷江百合不同器官中的表達水平，以及CMV侵染后該基因的表達模式，以便了解該基因的有關(guān)特性及其在抗病防御反應(yīng)中的功能，為揭示岷江百合抗病毒病的抗性機制和進一步開展百合抗病毒育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗所用植物材料為岷江百合(Liliumregale)、卷丹(L.lancifolium)和宜昌百合(L.leucanthum)，均取自西北農(nóng)林科技大學(xué)百合資源圃。已知岷江百合、卷丹和宜昌百合接種CMV后的相對抗病毒指數(shù)分別為0.64，0.64和0.18，抗病程度分別為高抗、高抗和高感[7]。黃瓜花葉病毒從百合資源圃中感染該病毒的西伯利亞百合(L.Oriental Hybrids ‘Siberia’)葉片中獲得。

采集正常生長的岷江百合嫩葉、嫩莖、花、鱗莖、根，液氮中冷凍后，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 病毒接種處理 將CMV毒源植株過夜處理后取嫩葉1 g，加入已滅菌稀釋至1 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 7.2)研磨后，加少量石英砂摩擦接種正常生長的岷江百合、卷丹和宜昌百合葉片，之后用蒸餾水沖洗，分別在接種后0，1，2，3，4，5和6 d取樣，將所取樣品液氮速凍后于-80 ℃保存。

1.2.2 岷江百合LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因全長的克隆 采用改良的CTAB法[25]提取百合葉片總RNA。反轉(zhuǎn)錄按照Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit進行。

根據(jù)已獲得的黃瓜花葉病毒誘導(dǎo)的岷江百合cDNA文庫中的EST核心序列設(shè)計3′RACE 特異引物，5′-GTAGGAGGAGCTAGCCATGGCCAAC-3′，巢式特異引物5′-GATCTCCCCGGTGTTAATGAGGGCG-3′；再根據(jù)獲得的基因3′端cDNA序列設(shè)計5′RACE 特異引物， 5′-ATCGGTTCGAGACCCATTGTGGTAGAA-3′，巢式特異引物5′-TGT-GTCTGCACTTGAGGCTGAAGAAGTA-3′。引物設(shè)計用Primer 5.0軟件進行，并委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

以接種黃瓜花葉病毒后不同時間的岷江百合葉片提取的RNA混合樣為模板，使用 BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech)進行 RACE cDNA 擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目標(biāo)條帶連接至pGEM-T Easy克隆載體(Promega)后測序(北京奧科鼎盛生物技術(shù)科技有限公司)。對測序獲得的LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的5′端序列和 3′端序列利用DNAstar軟件進行拼接，獲得岷江百合LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因cDNA 全長序列。

1.2.3 岷江百合LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的生物信息學(xué)分析 采用NCBI的ORF finder預(yù)測岷江百合LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的開放閱讀框；通過NCBI網(wǎng)站上的BLAST搜索LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的同源序列；用NCBI的 protein blast進行蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域分析；通過DNAman軟件分析LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的編碼氨基酸；利用MEGA 5.1 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；用ProtParam程序(http：//expasy.org/cgi-bin/protparam)預(yù)測LrNAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白的分子質(zhì)量和等電點；根據(jù)SignalP 4.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析LrNAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白的信號肽；用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域分析；據(jù)ProtScale (http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl )分析蛋白質(zhì)的親水性。根據(jù)Motif Scan(http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN/)研究蛋白 motifs。

1.2.4LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的器官特異性分析 根據(jù)已獲得的岷江百合LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因序列設(shè)計合成定量的引物，LrNAC-1：5′-ACTCCAAGT-GCGTCAAAAGGGC-3′，LrNAC-2:5′-CCTAACC-CTTCCGTCCACATTGA-3′；以18S rRNA(GenBank登錄號：D29775.1)為內(nèi)參基因，其引物為18S rRNA-1：5′-CATAAACGATGCCGACCAGGGA-3′，18S rRNA-2:5′-GTTTCAGCCTTGCGACCAT-ACTCC-3′。分別取岷江百合嫩葉、嫩莖、花、鱗莖、根等器官的總RNA各1 μg，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Perfect Real Time)(TaKaRa，Japan)的說明書進行實時熒光定量,在IQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad，USA)上檢測不同器官中該基因的相對表達量，每個樣品設(shè)3次重復(fù)。PCR 擴增程序為：95 ℃變性1 min；95 ℃變性30 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個循環(huán)。用Excel 2007和Origin 7.5對數(shù)據(jù)進行計算和處理，定量數(shù)據(jù)的處理方法采用2-ΔΔCT法。

1.2.5 CMV侵染后岷江百合LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的表達模式 分別取CMV處理后不同時間的岷江百合葉片總RNA 各1 μg進行表達模式分析，具體操作方法同1.2.4節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 岷江百合LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因全長cDNA序列的獲得

通過RACE擴增，得到長度為568 bp的3′cDNA序列和長度為365 bp的5′cDNA序列(圖1)，序列拼接后獲得827 bp的全長岷江百合LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因cDNA。

岷江百合LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因開放閱讀框(open reading frame，ORF)長627 bp，編碼208個氨基酸。將該轉(zhuǎn)錄因子基因命名為LrNAC,其核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列如圖2所示。

2.2 岷江百合LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的生物信息學(xué)分析

經(jīng)ProtParam預(yù)測LrNAC蛋白的分子質(zhì)量為23.4 ku,等電點為9.48，該蛋白為堿性蛋白。利用SignalP 4.1 Server分析可知，該序列無信號肽，為非分泌蛋白。通過ProtScale分析表明，LrNAC蛋白為親水性蛋白，其親水性氨基酸含量高于疏水性氨基酸含量。經(jīng)TMHMM預(yù)測該蛋白不具跨膜區(qū)。通過NCBI的protein blast分析顯示，LrNAC蛋白具有NAM結(jié)構(gòu)域(圖3),該結(jié)構(gòu)域?qū)儆贜AC轉(zhuǎn)錄因子家族中的保守結(jié)構(gòu)域。

通過Motif Scan分析表明，LrNAC蛋白含有1個酰胺化位點(第181-184位氨基酸)、1個N-糖基化位點(第114-117位氨基酸)、2個依賴于 cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點(第145-148、183-186位氨基酸)、4個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(第24-27、116-119、148-151和205-208位氨基酸)、3個N-豆蔻?；稽c(第62-67、100-105和185-190位氨基酸)和6個蛋白激酶 C 磷酸化位點(第34-36、72-74、92-94、105-107、135-137和186-188位氨基酸)，這說明該蛋白可能存在多種翻譯后水平的調(diào)控作用，以此來調(diào)控自身的表達情況。該編碼蛋白第15-163位氨基酸具有NAC家族保守結(jié)構(gòu)域。

氨基酸序列比對結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，LrNAC蛋白與其他植物中的NAC蛋白同源性均不是很高，其中與歐洲油菜(Brassicanapus，AFI56995.1)、葡萄(Vitisvinifera，XP_002264588.1)中NAC蛋白的同源性為50%，與蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，XP_003620957.1)、毛果楊(Populustrichocarpa，IPR003441)中NAC蛋白的同源性為49%，而與水稻(Oryzasativa，AAT02360.1)、馬鈴薯(Solanumtuberosum，CAC42087.1)、辣椒(Capsicumannuum，AAW48094.1)、小麥(Triticumaestivum，ADD10666.1)中NAC蛋白的同源性均低于40%。從圖4還可以看出，所有植物的NAC氨基酸序列在N端NAC結(jié)構(gòu)域區(qū)高度保守，在C端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)高度變異，這與NAC轉(zhuǎn)錄因子的特點相符[15]。

由圖5可以看出，LrNAC蛋白與擬南芥、陸地棉、蒺藜苜蓿中NAC蛋白的親緣關(guān)系相對近些，而與水稻、馬鈴薯、辣椒、小麥中抗病原菌相關(guān)的NAC蛋白的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，這與以上NAC氨基酸序列的同源性比對結(jié)果一致。

2.3 LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因在岷江百合不同器官中的表達

由圖6可以看出，LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因在岷江百合嫩葉、嫩莖、花、鱗莖、根中的相對表達量均不相同，其中在嫩葉中的相對表達量最高，在嫩莖中的相對表達量最低。說明LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因在岷江百合中存在組成型表達。

2.4 CMV侵染后百合中LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的表達模式

由圖7可見，CMV侵染3種百合后LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的相對表達量均明顯升高，在岷江百合、卷丹和宜昌百合中，LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的相對表達量達到最大值的時間分別為CMV處理后4 d、3 d和4 d，相對表達量的最大值分別為CMV處理前的38倍、3倍和13倍。由此可以看出CMV可以誘導(dǎo)百合LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的顯著表達，說明該基因可能在岷江百合抗黃瓜花葉病毒防御過程中發(fā)揮作用。已知植物可通過水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)等多種抗病信號傳導(dǎo)途徑，并借助NAC轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控來活化一大批防衛(wèi)反應(yīng)基因的協(xié)同表達,從而激活植物的抗病防衛(wèi)反應(yīng)[21]。植物抗病分子機制的復(fù)雜性導(dǎo)致了不同品種百合中LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因表達量的變化。

3 結(jié)論與討論

本研究中LrNAC蛋白與其他植物中的NAC蛋白同源性均低于50%，雖然同源性較低，但是利用Motif Scan分析可知，該蛋白具有NAC家族保守結(jié)構(gòu)域，因此可以確定本研究中克隆到的岷江百合中的新基因LrNAC是一個NAC轉(zhuǎn)錄因子基因。LrNAC蛋白與水稻、馬鈴薯、辣椒、小麥中4種抗病原菌相關(guān)的NAC蛋白[22，26-28]同源性均低于40%，親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)，雖然已有研究證實結(jié)構(gòu)相似的NAC轉(zhuǎn)錄因子有可能行使相似的生物學(xué)功能[9]，但不能簡單地根據(jù)同源性低或親緣關(guān)系遠(yuǎn)來否定LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因在岷江百合抗病毒中的作用。本研究測定了CMV侵染后該基因的表達模式，以此來分析其與岷江百合抗病毒的關(guān)系。

植物的抗病毒機制是由結(jié)構(gòu)抗病毒機制和生化抗病毒機制共同作用的。王仙芝[7]的研究表明，復(fù)合接種CMV和LMoV后岷江百合對2種病毒均表現(xiàn)為高抗，但其對病毒傳播媒介蚜蟲卻高感；接種初期岷江百合易感染病毒，但后期病毒在體內(nèi)的增長量很小,由此說明岷江百合的結(jié)構(gòu)抗病毒能力極弱，而生化抗病毒能力很強。后期本課題組對岷江百合中的LrPR10基因進行了克隆并分析了CMV侵染后該基因的表達模式，結(jié)果表明與抗性不同的其他種相比岷江百合該基因的表達量和表達時間均表現(xiàn)出很明顯的差異(結(jié)果尚未發(fā)表)，這就更加有力地證明了岷江百合中存在著特殊的生化抗病毒機制。

本研究中，CMV接種3種不同抗性的百合葉片后，LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因均上調(diào)表達，岷江百合中該基因表達量的最大值為處理前的38倍，而抗性不同的卷丹和宜昌百合僅為岷江百合的8%和34%；岷江百合中該基因達到最大值的時間是處理后第4天,而卷丹和宜昌百合分別為處理后3 d和4 d，結(jié)果表明LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因參與了岷江百合特殊的生化抗病毒機制，它與LrPR10基因共同在岷江百合的抗病毒過程中發(fā)揮著作用。

黃瓜花葉病毒誘導(dǎo)的岷江百合中LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及表達分析結(jié)果表明，LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因在岷江百合特殊的生化抗病毒機制中發(fā)揮了作用，從而提高了岷江百合抗病毒的機能，但LrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因的具體作用機制尚不清楚，還需進一步的研究。

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Cloning and expression analysis ofLrNACtranscription factor gene fromLiliumregaleinduced by cucumber mosaic virus

ZHANG Xiang-ling,LUO Jian-rang,ZHANG Yan-long,NIU Li-xin, SUN Dao-yang,LIANG Zhen-xu

(CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study investigated disease resistance mechanism ofLiliumregaleagainst cucumber mosaic virus (CMV) to improve breeding of antiviral lily.【Method】 Leaves ofL.regalewere treated by CMV and RACE technology was performed to clone the full length of NAC transcription factor gene (LrNAC).The obtained cDNA sequence was analyzed using bioinformatics methods.Real-time PCR was used to assess the expression ofLrNACtranscription factor gene in different organs ofL.regaleand the expression pattern was analyzed.【Result】 The full cDNA ofLrNACtranscription factor gene was 827 bp and it encoded a 208-amino acid peptide with a conserved domain of NAC transcription factor family.The protein without across the membrane was basic,hydrophilic and not secretory.The deduced sequence of amino acids ofLrNAChad a calculated molecular weight of 23.4 ku with a pI of 9.48.The relative expression level of this gene was highest in tender leaves,while lowest in tender stems.LrNACtranscription factor gene was up-regulated by CMV.After being inoculated by CMV,this gene peaked on 4 d,3 d and 4 d inL.regale,L.lancifoliumandL.leucanthum,respectively and the maximum expression values of treated samples were 38,3 and 13 times larger than the untreated ones. 【Conclusion】LrNACtranscription factor gene played a role inL.regaleagainst CMV.

Liliumregale;cucumber mosaic virus (CMV);LrNACtranscription factor gene;RACE;gene expression

2013-12-26

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)子項目(2011AA1008)

張響玲(1988-)，女，山東煙臺人，碩士，主要從事百合病毒病研究。E-mail:zxlzhangxiangling@163.com

羅建讓(1978-)，男，陜西寶雞人，講師，博士，主要從事園林植物資源評價和育種研究。 E-mail：luojianrang@nwsuaf.edu.cn

時間:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.030

S682.2+65

A

1671-9387(2015)06-0052-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.030.html